黑果枸杞對X 射線輻射小鼠的保護作用研究

段雅彬，姚星辰，王 財，陳湘宏，張娟玲，李向陽*

1青海大學醫學院;2 青海大學附屬醫院，青海 西寧 810001

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr)茄科枸杞屬，是西北地區特有的一種多棘刺灌木，主要產于青海柴達木盆地，其中含有大量的原花青素、花青素、多糖、維生素等營養成分。具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、清除自由基等作用［1，2］。黑枸杞藏藥名“旁瑪”，藏醫用于治療心熱病、心臟病、月經不調、停經等［3］。

輻射已是當今社會不容忽視的問題，化療病人人數逐年增加，高原惡劣的強紫外線環境，以及近年的核泄漏事件都成為威脅人類健康的重要因素。氨磷汀作為世界公認的抗輻射藥物能明顯保護機體組織，但引起血壓降低，惡心，嘔吐等癥狀使得其使用受限。目前對于黑枸杞的研究主要集中在成分提取與分析上，而其抗輻射作用未見報道。本研究通過黑枸杞對輻射小鼠的抗氧化系統、血液系統、DNA、細胞凋亡通路的保護闡明其抗輻射作用，為黑果枸杞的臨床開發提供理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗藥物

1.2 主要試劑

超氧化物岐化酶(SOD，批號:20140414);丙二醛(MDA，批號:20140412);谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX，批號:20140416);總抗氧力(T-AOC，批號:20140416);過 氧 化 氫 酶(CAT，批 號:20140417);總蛋白定量BCA 法(批號:20140508)均購自南京建成生物研究所。小鼠半胱氨酸蛋白酶3酶聯免疫檢測試劑盒(caspase3，批號:20141227.60325M);小鼠半胱氨酸蛋白酶6 酶聯免疫檢測試劑盒(caspase6，批號:20141227.60328M)均購自北京瑞格博科技發展有限公司。血液細胞分析儀用溶血劑(批號:2013111101);三分類探頭清潔液(批號:2013112101);血液細胞分析儀用稀釋液(批號:2013110701)均購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.3 主要儀器

醫用電子直線加速器(美國VaRian，23EX)，UV-2550 型紫外分光光度計(美國LabTech 公司)，TGL-16 B 型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)，KA-1000 型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，RE-52A 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHZ-IIID 型循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)，DK-2000-ⅢL 型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，KQ-250DB 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，RT-2100C 酶標儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)，DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，DRT-2N型電熱套(鄭州大城科工貿有限公司)，YDS-30 東亞液氮容器(樂山市東亞機電工貿有限公司)，BT224S 電子天平［賽多利斯科學儀器(北京)有限公司］，XW-80A 漩渦混合器(上海醫大儀器廠)，BC-2300 準全自動三分群血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。

1.4 動物

8 周齡SPF 級昆明種小鼠，雌雄各半，體重(25±2)g，購自甘肅中醫學院，合格證號:SCXK(甘)2011-0001。分籠飼養于青海大學醫學院實驗動物中心。飼養條件:光照明暗12 h 交替;自由飲水;溫度:(23 ±2)℃;適應性喂養3 d;每籠10 只群養。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

采用浸漬法，溶劑為水，時間4 h，液料比為1/20，溫度70 ℃。分別稱取黑枸杞及枸杞300 g，6000 mL 蒸餾水，70 ℃恒溫水浴鍋，避光浸泡4 h。旋轉蒸發儀70 ℃回收溶劑，過濾，定容到750 mL(終濃度為400 mg/mL)，4 ℃避光保存備用。

2.2 動物分組

取小鼠90 只，隨機分為6 組:正常對照組(Normal control)、陽性對照組(Positive)(氨磷汀，150 mg/kg)、輻射模型組(Model)、黑果枸杞高劑量(L.ruthenicum high dose group，LH)(8 g/kg)、中劑量(L.ruthenicum middle dose group，LM)(4 g/kg)、低劑量(L.ruthenicum lower dose group，LL)(2 g/kg)組，雌雄各半。

2.3 給藥方法

給藥組每日灌胃給藥，空白對照組、輻射模型組灌胃等容積生理鹽水，劑量為0.2 mL/10g，連續14 d;陽性組于照射前30 min 腹腔注射劑量為150 mg/kg 的氨磷汀溶液。

2.4 輻射條件

將每只小鼠單獨固定在自制模具中，采用美國VaRian 23EX 醫用電子直線加速器X-Rays 全身一次性照射，照射劑量5 Gy，吸收劑量率300 cGy/min，照射時間:100 s，視野40 ×40 cm，源皮距100 cm。

2.5 外周血象檢測

在照射后第7 d，摘眼球取血于含有EDTA-2Na抗凝管中制備全血，取全血20 μL 用血細胞稀釋液稀釋，室溫下放置3 min，血細胞分析儀進行外周血象檢測。

中國古典藝術批評對藝術創造波譎云詭的興發過程把握，往往能體貼生動，曲折盡致，典型如鄭板橋論述藝術創造:

2.6 臟器指數測定

在照射后第7 d 稱重，頸椎脫臼處死，解剖取胸腺、脾臟，除去脂肪及血污，濾紙吸干，稱重。按公式計算相應的臟器指數(%)。臟器指數(%)=臟器重量(g)/動物體重(g)×100%

2.7 骨髓DNA 含量測定

分別在照射后第7 d 頸椎脫臼處死剝離右側股骨，除凈組織及污血;剪斷第二股骨，用10 mL 0.005 mol/L CaCl2將全部骨髓沖入離心管中，反復沖洗直至股骨沖成白色為止。沖好的骨髓液置于4 ℃冰箱30 min，取出后2500 rpm 離心15 min，棄上清液，沉淀中加入5 mL 0.2 mol/L HClO4酸化，將沉淀物充分混勻，90 ℃水浴加熱15 min，流水冷卻，濾紙過濾，濾液用紫外可見分光光度計在260 nm 處測定吸光度A 值。

2.8 肝臟抗氧化酶活性測定

在照射后第7 d 稱重，頸椎脫臼處死，解剖取肝臟，精密稱取0.2 g 組織，用電動勻漿機制備10%勻漿，2000 rpm 離心10 min 取上清，SOD、GSH、CAT、MDA、T-AOC 及總蛋白檢測參照試劑盒方法。

2.9 Caspase-3 和Caspase-6 的測定

在照射后第7 d，摘眼球取血于EP 管，3000 rpm，10 min，分離血清。向酶標板中加入樣品及標準品，生物素標記的二抗和酶標試劑，37 ℃反應60 min，洗板5 次，加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min，加終止液，酶標儀讀OD 值。

2.10 統計學分析

用單因素ANOVA 方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，檢驗水準a=0.05。

3 實驗結果

采用SPSS 17.0 軟件對數據進行統計處理，所有數據均以均數±標準差()表示，多組比較采

3.1 黑果枸杞對輻射小鼠血象的影響

表1 顯示空白組WBC、RBC、HGB、明顯高于輻射組(P＜0.01)，說明造模成功。黑枸杞高中低劑量組RBC，HGB 高于輻射組(P＜0.01)，而WBC、PLT 無統計學意義。黑枸杞能增加RBC，HGB 的量但效果不如陽性藥物(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 黑果枸杞對輻射小鼠血象的影響(，n=10)Table 1 Effect of L.ruthenicum on the hemogram of mice after radiation(，n=10)

表1 黑果枸杞對輻射小鼠血象的影響(，n=10)Table 1 Effect of L.ruthenicum on the hemogram of mice after radiation(，n=10)

注:與模型組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與陽性組比較#P＜0.05，##P＜0.01。Note:vs model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;vs positive group #P＜0.05，##P＜0.01.

3.2 黑果枸杞對輻射小鼠臟器指數與DNA 含量的影響

表2 顯示黑枸杞中劑量與低劑量組DNA 含量高于輻射組(P＜0.01，P＜0.05)，但低于陽性藥物(P＜0.01)胸腺指數與脾臟指數無明顯差別(P ＞0.05)。說明黑枸杞對免疫系統無明顯影響。

表2 黑果枸杞對輻射小鼠臟器指數的影響(，n=10)Table 2 Effect of L.ruthenicum on the organ weight index and DNA content of mice after radiation(，n=10)

表2 黑果枸杞對輻射小鼠臟器指數的影響(，n=10)Table 2 Effect of L.ruthenicum on the organ weight index and DNA content of mice after radiation(，n=10)

注:與模型組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與陽性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:vs model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;vs positive group，#P＜0.05，##P＜0.01.

3.3 黑果枸杞對輻射小鼠抗氧化酶活性影響

表3 顯示黑枸杞能提高輻射小鼠SOD 活力(P＜0.01)，甚至優于陽性藥物(P＜0.01)減少脂質過氧化產物MDA 的量(P＜0.01)但是CAT、GSH-PX的活力降低(P＜0.05)，尤以低劑量明顯(P＜0.01)，對T-AOC 無明顯影響。

3.4 黑果枸杞對輻射小鼠caspase-3 及caspase-6的影響

表4 顯示黑枸杞低劑量組Caspase-3 的含量與模型組相比明顯降低(P＜0.01)，空白組Caspase-3的含量比輻射模型組低(P＜0.05)。Caspase-6 的空白組、黑枸杞中、低劑量組的含量要低于模型組(P＜0.01)。但高劑量組Caspase-3 和Caspase-6 的含 量升高，但無統計學差異。

表3 黑果枸杞對輻射小鼠抗氧化酶活力的影響(，n=10)Table 3 Effect of L.ruthenicum on the activity of antioxidant enzyme of mice after radiation(，n=10)

表3 黑果枸杞對輻射小鼠抗氧化酶活力的影響(，n=10)Table 3 Effect of L.ruthenicum on the activity of antioxidant enzyme of mice after radiation(，n=10)

注:與模型組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與陽性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:vs model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;vs positive group，#P＜0.05，##P＜0.01.

表4 黑果枸杞對輻射小鼠凋亡因子的影響(，n=10)Table 4 Effect of L.ruthenicum on the caspase-3 and caspase-6 of mice after radiation(，n=10)

表4 黑果枸杞對輻射小鼠凋亡因子的影響(，n=10)Table 4 Effect of L.ruthenicum on the caspase-3 and caspase-6 of mice after radiation(，n=10)

注:與模型組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與陽性組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:vs model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;vs positive group，#P＜0.05，##P＜0.01.

4 討論

血液系統是輻射敏感的靶器官，輻射后小鼠的血象明顯降低，而黑枸杞增加了RBC 與HGB 的含量，RBC 和HGB 都是運輸氧氣的重要介質，說明黑枸杞是通過增加輻射后小鼠體內的氧氣來對血液系統進行保護的。白細胞是機體的免疫因子，能間接反映機體的免疫力，而黑枸杞無明顯調節作用，說明其對機體的免疫系統影響不是通過增加白細胞數量來調節的，這一點在表2 中的臟器指數也得到證實，胸腺與脾臟是重要的免疫器官，而胸腺指數與脾臟指數無明顯變化，更加說明黑枸杞可能對機體的免疫系統無明顯影響，這一具體機制，需進一步研究。輻射后DNA 含量黑枸杞中劑量與低劑量組明顯增高，提示其對DNA 具有保護作用。

細胞凋亡因子與DNA 的修復關系密切，其中Caspase-3 和Caspase-6 是Caspase 家族的凋亡執行因子，二者同源性高，并且活化的Caspase-6 可以激活Caspase-3。Caspase-3 作為Caspase 家族的最重要成員，它的活化標志著細胞凋亡進入不可逆的階段［4］。Caspase-3 的激活可以切割參與DNA 修復的PARP(聚腺苷二磷酸核糖聚合酶)，而PARP 可以催化二磷酸腺苷核糖聚合物從異檸檬酸脫氫酶向靶蛋白的轉移，激活重要的修復因子，從而來達到DNA修復的目的［5-7］。輻射對DNA 造成嚴重的損傷，而前述已提到黑枸杞對DNA 有保護作用，并且黑枸杞能降低Caspase-3 的量，那么就能減少Caspase-3 對PARP 的切割，從而提高機體對DNA 的修復能力，減少細胞的凋亡。Caspase-6 是唯一一個可以剪切層蛋白的Caspase 成員，在細胞凋亡過程中，切割片層素蛋白，導致核纖層崩解，繼而使染色體凝集，細胞死亡［8］。黑枸杞能降低Caspase-6 的量，減少片層素蛋白的切割，保護染色體。輻射造成DNA 損傷，可能會引起細胞的癌變，那么這時降低Caspase-3 和Caspase-6 的量則導致腫瘤細胞的大量增殖。本實驗陽性藥物氨磷汀具有對細胞凋亡的雙重調節作用，即對腫瘤細胞增加凋亡因子的活性，對正常細胞抑制凋亡因子的活性［9］。表2 及表4 中可看出氨磷汀具有明顯的保護DNA 和降低caspase-3，caspase-6活性的作用，說明此實驗照射條件下的小鼠在第七天未發生癌變。那么黑枸杞降低細胞凋亡因子的作用是對機體有益的。

輻射后體內的活性氧(ROS)自由基大量增加，而ROS 是Caspase 激活的上游信號［10］，黑枸杞水提物含有花青素與原花青素，這兩個物質含有酚羥基，可以直接使自由基熄滅，這可能是黑枸杞降低Caspase-3 和Caspase-6 的機制。機體主要通過5 種途徑來提高抗氧化的能力:1.熄滅自由基;2.抑制氧化應激和凋亡的生物學改變;3.增加抗氧化酶活性;4.降低膜的流動性，抑制脂質過氧化;5.增加抗氧化蛋白的表達。表3 結果表明黑枸杞水提取液是通過增強SOD 活性來清除輻射所引起的自由基，MDA含量明顯減少，但其他抗氧化酶活性降低，T-AOC尤以低劑量降低明顯，反而輻射組的T-AOC 較強，可能自由基的產生能使機體代償的增強抗氧化能力，但由于輻射對DNA 的損傷，使代償作用無法比空白組的酶活性強，而黑枸杞含有酚羥基，直接熄滅自由基，使機體的代償減弱或消失，從而會抑制到CAT、GSH-PX、T-AOC 的活性。自由基的產生是一個動態平衡的過程，過多會損傷機體，而適量的自由基又有益于機體，所以當黑枸杞水提取物熄滅自由基后，機體的抗氧化酶活性降低，使得自由基達到動態平衡，這可能也是酶活性降低的一個原因。

輻射對機體的最重要損傷是DNA，而引起DNA損傷的“元兇”就是自由基，并且自由基對免疫系統也有破壞，但是機體也需要適量的自由基，其可激活體內的一些合成酶和解毒酶［11，12］，但是自由基是否也能增強抗氧化酶的活性，以及激活酶的機制是如何，這都有待進一步研究。

1 Lin L(林麗)，Zhang FS(張菲斯)，Jin L(晉玲)，et al.Research advance of Lycium ruthenicum Murr.China Pharm(中國藥房)，2013，24:4493-4496.

2 Plump GW，De Pascual-Teresa S，Santos-Buelga C，et al.Antioxidant properties of catechies and proanthocyanidins:effect of polymerisation，galloylation and glycosylation.Free Radic Res，1998，29:351-358.

3 Di Ma Er DZPC(帝瑪爾·丹增彭措).Jing Zhu Ben Cao(晶珠本草).Chengdu:Sichuan science and technology publishing house，1986.438-440.

4 Cryns V，Yuan J.Protease to die for.Genes Dev，1998，12:1551-1570.

5 Choi HN，Chung MJ，Park JK，et al.Neuroprotective effects of N-acetylglucosamine against hydrogen peroxide-induced apoptosis in human neuronal SK-N-SH cells by inhibiting the activation of caspase-3，PARP and p38.Food Sci Biotechnol，2013，22:853-858.

6 Rouleau M，Patel A，Hendzel MJ，et al.PARP inhibition:PARP1 and beyond.Nat Rev Cancer，2010，10:293-301.

7 Ferraris DV.Evolution of poly (ADP-ribose)polymerase-1(PARP-1)inhibitors.From concept to clinic.J Med Chem，2010，53:4561-4584.

8 Faleiro L，Kobayashi R，Fearnhead H，et al.Multiple species of CPP32 and Mch2 are the major active caspases present in apoptotic cells.EMBO J，1997，16:2271-2281.

9 Majsterek I，Gloc E，Blasiak J，et al.A comparison of the action of amifostine and melatonin on DNA-damaging effects and apoptosis induced by idarubicin in normal and cancer cells.J Pineal Res，2005，38:254-263.

10 Chan WH，Yu JS.Inhibition of irradiation-induced oxidative stress and apoptotic biochemical changes in human epidermal carcinoma A431 cells by genistein.Cell Biochem，2000，78:73-84.

11 Valavanidis A，Vlahogianni T，Dassenakis M，et al.Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.Ecotoxicol Environ Saf，2006，64:178-189.

12 Valdez LB，Arnaiz SL，Bustamante J，et al.Free radical chemistry in biological systems.Biol Res，2000，33(2):65-70.