咳喘停貼劑穴位貼敷對慢性哮喘大鼠肺組織促炎細(xì)胞因子的影響

劉蘭英喬 明高 峰王和生孫建華

（1.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210029；2.連云港市中醫(yī)院，江蘇連云港222001）

咳喘停貼劑穴位貼敷對慢性哮喘大鼠肺組織促炎細(xì)胞因子的影響

劉蘭英1喬 明2高 峰1王和生1孫建華1

（1.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210029；2.連云港市中醫(yī)院，江蘇連云港222001）

目的：觀察咳喘停貼劑穴位貼敷治療對慢性哮喘大鼠Th2下游促炎細(xì)胞因子含量的影響。方法：48只Wistar大鼠隨機分成6組：正常組、哮喘模型組、地塞米松組、假穴位貼敷組、穴位貼敷組、布地奈德組，每組8只。除正常組外，其余各組大鼠用卵蛋白（OVA）致敏和激發(fā)來制備慢性過敏性哮喘大鼠模型。正常組和哮喘模型組正常喂養(yǎng)不做其他處理，地塞米松組予地塞米松腹腔注射，布地奈德予布地奈德霧化吸入，假穴位貼敷組予凡士林貼劑貼敷于雙側(cè)背俞穴，穴位貼敷組予咳喘停貼劑貼敷于雙側(cè)背俞穴。各組大鼠均予相應(yīng)治療14d后，觀察肺組織細(xì)胞學(xué)變化及支氣管肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-13含量差異。結(jié)果：正常組大鼠肺泡形態(tài)規(guī)則，肺間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤；模型組和假穴位貼敷組大鼠肺泡腔縮小，其內(nèi)見炎性細(xì)胞浸潤及黏液栓，肺間質(zhì)增厚，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；其余各用藥組均較模型組有所改善。與模型組比較，正常組、地塞米松組、布地奈德組大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6、IL-13含量明顯降低；穴位貼敷組支氣管肺泡灌洗液中IL-6、IL-13含量明顯降低，而IL-4含量有降低趨勢，與地塞米松組、布地奈德組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：咳喘停穴位貼敷可通過顯著降低慢性哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-13含量來減輕慢性氣道炎癥。

咳喘停貼劑 慢性哮喘 穴位貼敷 促炎細(xì)胞因子 肺 病理學(xué) Wistar大鼠

慢性氣道炎癥是支氣管哮喘反復(fù)發(fā)作的主要病理機制之一。輔助性T細(xì)胞2（Th2）產(chǎn)生以白介素4、6、13（IL-4、IL-6、IL-13）等為代表的促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致慢性氣道炎癥加重[1]。吸入性糖皮質(zhì)激素是目前主要的抗炎治療方法之一，但其長期使用會出現(xiàn)激素依賴與抵抗現(xiàn)象，導(dǎo)致療效不佳，病情易反復(fù)發(fā)作，患者依從性較差[2]。我們前期研究表明，咳喘停貼劑以白芥子、生甘遂、延胡索、細(xì)辛為主藥，在三伏天貼敷于肺、脾、腎三臟背俞穴可有效減輕哮喘復(fù)發(fā)頻率和程度。為探索其作用機制，本研究建立慢性過敏性哮喘大鼠模型，觀察咳喘停貼劑穴位貼敷治療對IL-4、IL-6、IL-13等促炎細(xì)胞因子含量的影響，從而探討該療法對Th2相關(guān)氣道促炎作用的可能調(diào)節(jié)機制，并與地塞米松和布地奈德作對照。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選擇SPF級雄性wistar大鼠48只，上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，許可證號:SCXK滬20080016，6周齡，體重（160±20）g，在室溫（18～22）℃、濕度28%環(huán)境中飼養(yǎng)1周后使用。

1.2 實驗儀器 超聲霧化器（型號:魚躍402AI）；自制非完全密閉玻璃箱 （30cm×40cm×50cm）；Leica生物組織自動脫水機、石蠟包埋機、全自動輪轉(zhuǎn)石蠟切片機、全自動脫水機、自動染色機等（德國萊卡公司）；雅博200型攤烘烤片機（常州雅博電子設(shè)備有限公司）；DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實驗設(shè)備廠）；Olympus BX-51型病理圖像采集系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司，型號:THZ-312）；BioTek酶標(biāo)儀 （美國伯騰儀器有限公司，型號: 240351）等。

1.3 實驗試劑 卵蛋白（OVA）:美國sigma公司生產(chǎn)（規(guī)格:GradeⅤ5503，純度≥98%）；氫氧化鋁（分析純，天津博迪化工股份有限公司）；地塞米松磷酸鈉注射液（1mL:5mg，山西晉新雙鶴藥業(yè)）；布地奈德混懸液（2mL:1mg，阿斯利康制藥有限公司）；TO透明劑（廣西岑溪市松香廠）；伊紅Y二鈉鹽、蘇木素（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）。以下試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司:IL-4（批號: KGER030），IL-6（批號:KGERC003），IL-13（批號: KGER037）。

1.4 藥物 咳喘停貼劑，由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑部制備，藥物組成:白芥子、延胡索、生甘遂、細(xì)辛、麻黃、葶藶子、肉桂、丁香、豬牙皂，分別打粉過200目篩，按2∶2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1比例充分混合后加生姜汁、凡士林，做成直徑為1cm藥丸，重約0.3g。假貼劑:面粉加同上比例的生姜汁、凡士林做成直徑為1cm的藥丸，重約0.3g。地塞米松磷酸鈉注射液:5mg/支。布地奈德霧化混懸液:1mg/支。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 大鼠48只，稱重后隨機分成6組，分別為正常組、哮喘模型組、地塞米松組、假穴位貼敷組、穴位貼敷組、布地奈德組，每組8只。

2.2 建立慢性哮喘大鼠模型 除正常組外，其余各組大鼠參考Palmans[3]方法制備卵蛋白（OVA）致敏慢性哮喘氣道炎癥大鼠模型。從第1天首次接受OVA注射至第14天為致敏階段，第15天到第56天為持續(xù)激發(fā)階段（6周）。致敏階段:第1天予大鼠腹腔注射OVA和氫氧化鋁混合溶液1mL（含OVA10mg、氫氧化鋁 100mg）；第8天再次腹腔注射加強致敏。激發(fā)階段:第15天開始，將大鼠放于自備密閉霧化箱內(nèi)，予1%OVA溶液霧化吸入，每次30min，隔日1次，其間觀察大鼠噴嚏、呼吸、口唇、腹部及活動度等反應(yīng)，直到第56天霧化結(jié)束。正常組大鼠活動正常，無喘促等表現(xiàn)，其余各組大鼠表現(xiàn)為毛發(fā)暗淡、豎毛、倦怠。霧化激發(fā)時部分大鼠出現(xiàn)典型哮喘樣發(fā)作，如呼吸急促、喘息、點頭呼吸、腹部翕動、行動減少，并隨著激發(fā)次數(shù)增加癥狀逐步加重。部分大鼠出現(xiàn)陣發(fā)性噴嚏，隨著激發(fā)次數(shù)增加噴嚏次數(shù)增加。

2.3 分組治療 第57天起對各組大鼠進行相應(yīng)處理。正常組、哮喘模型組:正常喂養(yǎng)不做其他處理；地塞米松組:予地塞米松每日1mg/kg，腹腔注射，每日1次；布地奈德組:予布地奈德10mg（20mL）霧化吸入30min，共治療14d；假穴位貼敷組:予假貼劑貼敷于雙側(cè)肺俞、脾俞、腎俞穴，取穴方法參考李忠仁主編的 《實驗針灸學(xué)》[4]，在穴區(qū)脫毛后將藥丸壓成直徑約1cm圓形，用膠布固定到穴位上，6h后去除，每日1次，共治療14d[5]；穴位貼敷組:予咳喘停貼劑貼敷于上述穴位，方法同假穴位貼敷組。

2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法 用10%水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后，消毒皮膚，打開胸腔，夾閉其右主支氣管，從氣管緩緩注入生理鹽水4mL灌洗左肺，反復(fù)3次，離心，取其上清液并進行分裝，ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-6、IL-13含量，按試劑盒說明進行操作。取右肺中葉，在4°C生理鹽水中漂洗干凈，立即投入10%的甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋，切片。HE染色，觀察肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，檢測結(jié)果以（±s）表示，應(yīng)用正態(tài)分布，方差齊的組間差異性比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布或者方差不齊，采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗）。P＜0.05表示有顯著性差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 見圖1。正常組大鼠肺泡形態(tài)規(guī)則，肺間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肺泡腔縮小，其內(nèi)見炎性細(xì)胞浸潤及黏液栓，肺間質(zhì)增厚，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。假穴位貼敷組與模型組大鼠相似，肺泡腔縮小，其內(nèi)見炎性細(xì)胞浸潤及黏液栓，肺間質(zhì)增厚，可見大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組比較，地塞米松組大鼠可見肺大泡，肺泡內(nèi)黏液栓明顯減少，肺間質(zhì)略增厚；穴位貼敷組大鼠可見部分肺大泡，肺泡腔內(nèi)少量黏液栓，肺間質(zhì)略增厚，其內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤；布地奈德組大鼠支氣管腔內(nèi)黏液栓減少，肺間質(zhì)增厚，可見炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變（HE染色，10×10）

3.2 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-6、IL-13等促炎細(xì)胞因子含量比較 見表1。與正常組比較，哮喘模型組、假穴位貼敷組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-6、IL-13含量明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，地塞米松組、布地奈德組大鼠IL-4、IL-6、IL-13含量明顯降低（P＜0.05）；穴位貼敷組IL-4含量有降低趨勢，IL-6、IL-13含量明顯降低（P＜0.05）。穴位貼敷組與地塞米松組、布地奈德組上述促炎細(xì)胞因子含量比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 治療后各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-6、IL-13含量比較（±s） pg/mL

表1 治療后各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-6、IL-13含量比較（±s） pg/mL

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只）IL-4IL-6 IL-13正常組81.45±0.44#21.98±1.38#25.07±3.92#哮喘模型組 8 4.46±2.93*24.87±1.38*34.40±4.13*假穴位貼敷組 8 3.03±1.03*23.80±2.14*37.04±3.68*地塞米松組 8 1.74±0.50#22.14±2.01#27.99±3.30#布地奈德組 8 1.98±1.11#22.57±1.61#28.75±3.55#穴位貼敷組 8 2.34±1.35 22.94±1.99#25.60±6.52#

4 討論

IL-4是Th2特征性細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)B細(xì)胞合成IgE，促使組胺、前列腺素、白三烯釋放，導(dǎo)致支氣管平滑肌收縮，血管擴張、通透性增加，氣道黏液分泌增加，則患者出現(xiàn)喘息、氣急、胸悶或咳嗽。研究表明，哮喘模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-13水平及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)均較正常小鼠顯著升高[6]，本研究亦證實了此結(jié)果。IL-6由氣道巨噬細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是引起氣道炎癥的重要細(xì)胞因子之一。樊德利等[7]研究顯示，哮喘患者急性發(fā)作期IL-6含量顯著高于緩解期及健康人群。IL-13促進了哮喘氣道上皮杯狀細(xì)胞化生和黏液的高分泌。嗜酸性粒細(xì)胞是支氣管黏膜損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞，其釋放顆粒（內(nèi)含堿性蛋白、陽性蛋白及白三烯）導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和氣道高反應(yīng)性，進一步加重氣道炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，咳喘停穴位貼敷可顯著降低哮喘模型大鼠支氣管肺泡中IL-6、IL-13含量，此效應(yīng)與地塞米松及布地奈德相當(dāng)，而對IL-4含量影響不大。由此推測，咳喘停貼劑可能通過降低支氣管肺泡中IL-6、IL-13含量來發(fā)揮抗炎作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慢性哮喘多為冷哮，與肺、脾、腎關(guān)系密切。若三臟之陽氣不足，宿痰無以清除，則為喘疾也。其治療多參照《張氏醫(yī)通·諸氣門下·喘》:“冷哮……夏月三伏中，用白芥子涂法，往往獲效。方用白芥子凈末一兩，延胡索一兩，甘遂、細(xì)辛各半兩，共為細(xì)末，入麝香半錢，杵勻，姜汁調(diào)涂肺俞、膏肓、百勞等穴……十日后涂一次，如此三次，病根去矣。”“治臟者治其俞”，本研究選取肺俞、脾俞、腎俞三臟背俞穴，調(diào)整肺、脾、腎三臟功能。咳喘停貼劑以《張氏醫(yī)通》中白芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛為基礎(chǔ)，加以葶藶子、肉桂、麻黃、丁香等辛溫之品，具有溫肺化痰、行氣利氣、消腫散結(jié)的功效。研究表明，白芥子主要成分是硫代異氰酸對羥芐酯，小劑量即能引起反射性增加氣管分泌，有祛痰的作用，其水解產(chǎn)物白芥油可導(dǎo)致皮膚充血、發(fā)泡[8]；甘遂水煎劑提取物可使實驗小鼠脾臟增重和胸腺減輕，能抑制實驗小鼠抗羊紅細(xì)胞抗體產(chǎn)生，并可明顯抑制由SRBC誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)[9]。

本研究結(jié)果表明，咳喘停貼劑可以明顯改善慢性哮喘模型大鼠肺泡組織病理變化，其可能的機制是通過降低支氣管肺泡中IL-6、IL-13含量。在今后的研究中將進一步關(guān)注以Th1/Th2為核心的免疫調(diào)節(jié)失衡在慢性氣道炎癥中的作用，以及咳喘停貼劑對其的調(diào)節(jié)作用。

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R562.250.5

A

1672-397X（2015）02-0077-03

劉蘭英（1974-），女，研究生學(xué)歷，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：穴位貼敷治療支氣管哮喘療效評價及作用機理研究。bluelany@163.com

2014-10-12

編輯：吳 寧

國家自然科學(xué)基金（81102632）