響應面法優化太白貝母粗多糖超聲波提取工藝研究

陳 林，韓 林，周 濃*，李 花，詹莉娟

1重慶三峽學院生命科學與工程學院;2 重慶市食品基礎實驗教學中心，重慶 404100;3 廣西大學化學化工學院，廣西 531499

太白貝母，多年生草本，為百合科植物太白貝母Fritillary taipaiensis P.Y.Li 的鱗莖［1］。貝母具有化痰、潤肺、止咳功效。太白貝母長期作為川貝母使用，其地理分布、植物形態、有效成分與川貝母無明顯差異［2］。貝母作為藥食同源植物具有一定的保健作用。多糖化合物廣泛存在于中藥中，生物類多糖在抗腫瘤、抗衰老等方面發揮著重要的生物活性［3］。隨著市場需求的增長，野生貝母資源已面臨枯竭，而太白貝母栽培技術成熟并有一定規模，具有較高的研究空間。

超聲波提取法最大優點是節約能源和時間。它利用超聲波的空化效應［4］，使植物活性成分在不被破壞的情況下溶出，且體系溫度不會大幅度升高。響應面分析方法(Response Surface Methodology，RSM)是一種優化工藝條件的有效方法［5，6］，可用于確定各種因素及其交互作用在工藝過程中對指標(響應值)的影響，精確的表述因素和響應值之間的關系。本試驗以太白貝母為研究對象，在單因素試驗基礎上，運用響應面法優化超聲波提取太白貝母粗多糖，為深層次開發利用當地貝母資源提供試驗和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、藥品及儀器

太白貝母:重慶巫溪地區采集鮮品，經成都中醫藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室王光志副教授鑒定為百合科植物太白貝母F.taipaiensis 的干燥鱗莖;葡萄糖標準品:上海一基生物試劑有限公司;石油醚、無水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、蒽酮、濃硫酸均為分析純。

UV-2450 型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，CP225D 型分析天平(德國Sartorius 公司)，SB 25-12DTW 超聲波提取機(寧波新基生物科技股份有限公司)，FA1004 萬分之一天平(上海市舜宇恒平科學儀器有限公司)，TDZ5-WS 多管架自動平衡離心機(賽特湘儀離心機儀器有限公司)，101 FAR-1 型電熱鼓風干燥箱(黃驊市卸甲綜合電器廠)，IKA HB10 basic 旋轉蒸發儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 太白貝母粗多糖的提取

太白貝母粗多糖的提取流程:

樣品處理→脫脂→過濾、烘干、稱量→超聲提取→離心分離→上清液濃縮→Sevage 法脫蛋白離心分離→乙醇沉淀多糖→離心分離→風干→粗制多糖

1.2.2 蒽酮硫酸法測定多糖的含量

多糖的提取率%=(太白貝母粗多糖質量/貝母樣品質量)×100 %

1.2.3 太白貝母粗多糖提取溫度的選擇

精確稱取6.0 g 太白貝母干粉6 份，料液比為1∶15，考察提取溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)條件下超聲輔助提取15 min，過濾，濾液濃縮干燥后稱重，計算多糖提取率。

1.2.4 太白貝母粗多糖提取時間的選擇

精確稱取6.0 g 太白貝母干粉6 份，在料液比為1∶15，溫度80 ℃的條件下，考察提取時間(5、10、15、20、25、30 min)，過濾，濾液濃縮干燥后稱重，計算多糖提取率。

1.2.5 白貝母粗多糖提取料液比的選擇

精確稱取6.0 g 太白貝母干粉6 份，在提取時間為15 min、提取溫度80 ℃的條件下，考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)過濾，濾液濃縮干燥后稱重，計算多糖提取率。

1.2.6 太白貝母粗多糖提取工藝的響應面法優化［7，8］

在單因素試驗的基礎上分別以提取溫度、時間及料液比3 因素為考察對象，以多糖提取率為響應值，采用響應分析進行提取條件的優化。

1.2.7 可見光分光光度法標準曲線的制備

選用葡萄糖標準品在480 nm 波長處測定吸光度，繪制標準曲線。回歸方程為Y=0.732287X +0.03176，R=1.000。

1.2.8 統計學分析

使用SAS9.0 統計軟件對試驗數據進行回歸分析，每組試驗均重復三次，預測貝母粗多糖提取的最優工藝參數和進行試驗驗證。

2 結果與分析

2.1 提取溫度、提取時間及料液比對太白貝母粗多糖提取率的影響

圖1 為不同溫度、時間及料液比下太白貝母粗多糖提取率。在料液比1∶15、水提時間15 min、80℃時太白貝母粗多糖提取率較高(A)。一般來說，升溫有利于獲得較高的提取率，但溫度超過80 ℃，糖鏈斷裂導致多糖降解。綜合考慮，選擇70～80 ℃為宜。

水浴溫度80 ℃，料液比1∶15，隨著超聲波提取時間的延長，太白貝母粗多糖提取率呈先增加后下降趨勢(B)。由于短時間內超聲波對細胞的破壞作用較大，多糖溶出較多，所以提取率高。當提取時間超過15 min，粗多糖溶解度趨于飽和，多糖提取率逐漸下降。隨著超聲時間的延長，細胞進一步破裂，溶解的雜質也會相應增多。因此，選取15～20 min 為宜。

圖1 提取溫度(A)、提取時間(B)及料液比(C)對提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature (A)，time (B)and solid/liquid ratio (C)on the extraction yield of crude polysaccharide

水浴溫度為80 ℃，水提時間15 min 的條件下，當料液比從1∶5 提高到1∶20 時，提取率從2.5%升高到7.2%，再提高比例則提取率升幅趨緩(C)。可能是少量溶劑很快被滲出的多糖飽和，擴散推動力減小;當溶劑量足夠大時，對超聲波的提取基本無阻礙，提取率顯著增加。

2.2 響應面法分析優化試驗

根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，確定中心組后試驗的因素和方法，以粗多糖得率為響應值。超聲輔助提取貝母粗多糖的響應面試驗的3 因素5 水平提取條件(表1)進行優化試驗設計與結果(表2)SAS9.2 統計軟件對試驗數據進行回歸分析，回歸模型的方程為:

表1 太白貝母粗多糖提取響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of central composite test on extraction of polysaccharide

表2 太白貝母粗多糖提取響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and result of central composite test on extraction of polysaccharide

對該模型的方差分析(表3)。從此模型的方差分析表可知，響應面回歸模型達到極顯著水平(P=0.0002＜0.01)，復相關系數R2為0.9541，說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結果，試驗誤差小。

表3 回歸方程的方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression model

從二次多項式回歸模型系數的顯著性檢驗結果(表4)可知，在所選的各因素水平范圍內，對結果影響因素大小順序為:提取溫度＞提取時間＞料液比。其中，X1、X2、X1X1、X3X3對Y 的影響極顯著，X2X2對Y 的影響顯著，X3、X1X2、X1X3、X2X3對Y 的影響不顯著。

表4 二次多項式回歸模型系數的顯著性檢驗結果Table 4 Regression coefficients of predicted quadratic polynomial model

利用SAS 繪制各種因子對得率的響應面和等高線圖，結果見圖2。等高線的性狀可以反映出交互效應的強弱大小，圓形表示兩交互作用不顯著，橢圓形表示兩者交互作用顯著。

圖(a)表明了料液比取中心水平時，提取溫度與超聲波提取時間對太白貝母粗多糖得率的交互作用。在試驗水平范圍內，提取溫度與提取時間之間的交互作用顯著。隨著提取溫度的增加貝母粗多糖得率呈先增加后逐漸減小的趨勢，超聲時間較短時提取溫度的影響顯著，表現為先增加后減小的過程。在超聲時間較長時提取溫度對貝母粗多糖的得率影響不大。圖(b)可知，試驗范圍內貝母粗多糖得率隨著提取時間和料液比的增加呈現出迅速增加后逐漸減小的情況，在低水平區兩者的交互作用對貝母粗多糖得率的影響高于兩者高水平區。圖(c)顯示等高線的形狀趨近于圓形，說明了提取溫度與料液比之間的交互作用較不顯著，在試驗范圍內隨著料液比的增加太白貝母提取率呈先增加后緩慢減小的趨勢。

根據Box-Benhnken 試驗所得到的數據結果和回歸方程，用SAS9.2 統計軟件對試驗數據進行回歸分析響應值最大時，提取溫度、提取時間、料液比對應的編碼值分別為 X1=0.312945、X2=0.003718、X3=0.234869 實際值為:提取溫度75.3℃，提取時間為15.8 min，料液比為1∶15.4。為實際操作方便選取提取溫度75 ℃，提取時間16 min，料液比1∶15。

圖2 因素交互作用對太白貝母粗多糖提取率影響的響應曲面和等高線Fig.2 Response surface plots showing the effects of extraction parameter on the extraction yield of FTP

3 結論

根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上采用3 因素5 水平的相應面分析方法對太白貝母粗多糖提取工藝進行了優化，取得了較好的試驗效果。結果顯示貝母粗多糖提取的最佳提取工藝參數為∶提取溫度75 ℃，提取時間為16 min，料液比為1∶15，總糖的含量為0.461%。同時得到太白貝母粗多糖提取率與各因素變量的二次多項式回歸方程，該模型回歸顯著，具有實際應用價值。

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