響應面法優化超聲輔助提取貫眾多酚工藝

陸 洋，彭 飛，黃麗霞，習偉佳，馬吉福，馬 驥

陜西師范大學生命科學學院 教育部藥用植物資源及天然藥物化學重點實驗室，西安 710119

貫眾(Cyrtomium fortunei J.Sm)為鱗毛蕨科(Dryopteridaceae)貫眾屬(Cytomium)多年生蕨類植物，其根狀莖富含多酚、多糖、黃酮、甾萜類、氨基酸等多種化合物，藥用價值極高，為我國主要中藥貫眾的原植物之一［1］。貫眾可全草入藥，具有清熱解毒、驅蟲、抗菌、抗腫瘤、止血、降脂等作用［2］。多酚是指分子結構中有若干個酚性羥基的酚類化合物，又稱植物單寧，主要有游離態和結合態，后者更能完好到達腸道產生生理活性。多酚主要存在于植物的皮、根、葉、果中，被喻為“第七大營養物質”，具有較強的抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、殺菌等生物活性［3-7］，目前多用于保健品、化妝品、中藥類產品，具有廣闊的市場前景。目前關于貫眾的研究包括化學成分和藥理作用［8］等方面，但整體的研究力度還相對較少，不夠完善。超聲波可通過機械破碎和空化作用使細胞破碎，利于細胞內容物的溶出，且具有相對微波法提取效率高、成本低、便于實現大規模生產等優點［9］，本實驗首次研究響應面法優化超聲輔助提取貫眾中多酚的工藝，經驗證，該工藝穩定可靠，提取率高，這為進一步開發利用貫眾，發揮其作用，如制成天然保健品、化妝品等，提供很好的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貫眾采收于陜西省寧陜縣旬陽壩地區，經陜西師范大學馬驥副教授鑒定為鱗毛蕨科植物貫眾Cyrtomium fortunei J.Sm 的干燥根狀莖;沒食子酸標準品，中國藥品生物制品檢定所;福林酚試劑，上海荔達生物科技有限公司;無水碳酸鈉，天津市風船化學試劑科技有限公司;無水乙醇，天津市紅巖化學試劑廠;所用化學試劑為分析純;實驗用水為超純水。

HH-6B 數顯恒溫水浴鍋，江蘇常州國華電器有限公司;KQ-300DE 型數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司;SL202N 型藥物電子天平，上海明橋精密科學儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵、RE-52AA 旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;TG16-WS 型臺式高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;Epoch 超微量微孔板分光光度計，美國BioTek;FZ102 微型植物粉碎機，黃驊市中興有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

貫眾→洗凈→分離根狀莖→陰干→粉碎→過60 目篩→石油醚脫脂→晾干→超聲提取→離心→抽濾→旋蒸→定容→測量吸光度→計算多酚含量。

1.2.2 多酚標準曲線的繪制

精確稱取一定量的干燥沒食子酸標準品置于容量瓶中，加入無水乙醇定容，得0.1 mg/mL 的標準品溶液。依次吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 的標品溶液置于10 mL 的具塞試管中，加入福林酚試劑2.5 mL，加蒸餾水3 mL，搖勻，30 s 后加入1 mL 15%的碳酸鈉溶液，搖勻后，蒸餾水補至5 mL，25 ℃避光保存1 h 后，在750 nm 處測定吸光值［10-12］，以沒食子酸質量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得y=13.113x +0.0615，R2=0.9996，結果表明兩變量有很強的線性相關性。

1.2.3 貫眾中多酚得率的測定

準確吸取1 mL 貫眾多酚提取液于具塞試管中，用蒸餾水稀釋5 倍至5 mL，取稀釋液0.1 mL，與1.2.2 中同樣的方法顯色，在750 nm 下測吸光值，根據標準曲線計算多酚得率。

式中:Y-多酚得率(%)，A-吸光值，b-標準曲線截距，N-樣液稀釋倍數，V-樣液定容體積(mL)，a-標準曲線斜率，M-貫眾根狀莖粉末質量(g)。

1.2.4 單因素試驗

分別選取乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度四因素做單因素試驗，取三次重復的平均值，考察各因素對貫眾多酚得率的影響。

1.2.4.1 乙醇濃度對多酚得率的影響

選取乙醇濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，在料液比1∶30，溫度50 ℃下超聲提取40 min，探究乙醇濃度對貫眾多酚得率的影響。

1.2.4.2 超聲時間對多酚得率的影響

選取超聲時間分別為10、20、30、40、50 min，在乙醇濃度50%，料液比1∶30，溫度50 ℃下超聲提取不同時間，探究超聲時間對貫眾多酚得率的影響。

1.2.4.3 超聲溫度對多酚得率的影響

選取超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃，在乙醇濃度50%，料液比1∶30 下超聲提取40 min，探究超聲溫度對貫眾多酚得率的影響。

1.2.4.4 料液比對多酚得率的影響

選取料液比分別為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1∶50 mL/g，在乙醇濃度50%，溫度50 ℃下超聲提取40 min，探究料液比對貫眾多酚得率的影響。

1.2.5 響應面設計

在單因素試驗的基礎上，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)四個因素為自變量，以多酚得率為響應值，采用Design-Expert.8.05b 軟件中的Box-Behnken Design，即BBD 試驗設計方法進行設計。各因素水平及編碼見表1。

表1 響應面分析因子及水平表Table 1 Factors and levers of RSM analysis

1.2.6 數據分析處理

用Design-Expert.8.05b 軟件對實驗數據進行分析處理并對各因素間的交互作用做回歸分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

圖3 乙醇濃度(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)及料液比(D)對貫眾多酚得率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration (A)，ultrasonic time (B)，ultrasonic temperature (C)and solid-liquid ratio (D)on the yield of polyphenols

乙醇濃度對多酚得率的影響如圖3(A)，隨著乙醇濃度的增加，多酚得率先增加后降低，其中提取溶劑為40%的乙醇時，多酚得率最大。原因可能為多酚含有酚性羥基，貫眾中多酚與40%乙醇極性較接近，所以在其中溶解度大。選擇乙醇濃度為40%為最佳濃度。

超聲時間對多酚得率的影響如圖3(B)，隨著超聲時間的增加，多酚得率先迅速增加后緩慢降低，超聲時間為30 min 時，多酚得率最大。原因可能為多酚的提取需要一定的時間，在一定范圍內，隨著時間的延長，多酚得率升高。而時間超過一定限度時，可能會增加雜質的溶出，破壞多酚的結構，因此選擇30 min 為最優超聲時間。

超聲溫度對多酚得率的影響如圖3(C)，在溫度小于50 ℃時，多酚得率隨著超聲溫度的升高而升高，大于50 ℃時，隨著溫度的升高而降低。原因為隨著溫度的升高，分子運動加快，提高多酚的溶出率，但是達到一定限度后，由于多酚的酚羥基化學性質較活潑，熱穩定性不夠強，結構被破壞，所以多酚得率降低。選擇超聲溫度50 ℃最優。

料液比對多酚得率的影響如圖3(D)，可以看出，貫眾多酚隨料液比的增加而逐漸增大，當料液比大于1∶30 時，曲線雖有少量提升但逐漸趨于平緩，考慮到操作實際和節約能源方面，選擇料液比1∶30為最優。

2.2 響應面分析及其對提取工藝的最優化

根據Box-Benhnken 中心組合試驗設計原理［13］，設計響應曲面試驗，如表2。

表2 中心組合試驗設計及結果Table 2 The result of central composite design

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the developed polynomial model

注:* 表示顯著(0.05＜P＜0.01)，＊＊表示極顯著(P＜0.01)。Note:* significant difference (0.05＜P＜0.01)，＊＊very significant difference (P＜0.01).

利用Design-Expert.8.05b 軟件，對表2 數據分析，得到多酚得率隨乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度的回歸方程為:

貫眾多酚得率Y=7.82+0.12A+0.25B +0.00125C-0.05D-0.10AB+0.16AC+0.16AD-0.18BC-0.13BD-0.076CD-0.22A2-0.19B2+0.026C2-0.26D2

回歸模型方差分析見表3，總模型極顯著(P＜0.01)，說明二次多項模型具有極高的顯著性，不同因素差異顯著，失擬項不顯著(P=0.9230＞0.05)，模型選擇合適。校正決定系數=0.8966，表明貫眾多酚得率可較準確(89.66%)地由該模型進行試驗預測。R2=0.9483，表明回歸方程擬合度良好。由P 值可看出各因子對貫眾多酚得率的影響順序為:料液比(P＜0.0001)＞乙醇濃度(P=0.0007)＞超聲時間(P=0.0806)＞超聲溫度(P=0.9634)。交互項除CD 外均顯著(P＜0.05)，其中AC、AD、BC 對多酚得率的影響為極顯著(P＜0.01)。說明乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時間對貫眾多酚得率的交互影響較單獨影響更為顯著，實驗因素對響應值的影響不成簡單的線性關系。

圖4 各交互作用對貫眾多酚得率影響的響應曲面Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the yield of polyphenols

同時，根據表2 實驗所得的響應面圖為圖4(A～F)，反映了乙醇濃度、液料比、超聲時間和超聲溫度四因素之間交互作用對貫眾中多酚提取率的影響。每幅圖為四因素中，任意兩個因素處于零水平，即最優條件時，另外兩個因素的交互作用對貫眾多酚得率的影響。

在圖4 中，若響應曲面圖的坡度較平緩，說明隨著處理條件的變化，響應值變化較小，如圖4(B、F);反之，曲面陡峭，則響應值變化大，如圖4(A、C～E)。在圖4(A)中，多酚得率隨料液比的增加而增加，隨乙醇濃度的增加先升高后降低，這與單因素實驗結果基本吻合，但是，在料液比增加的情況下，隨著乙醇濃度的增加，多酚得率的上升趨勢表現明顯，后降低趨勢較弱，與單因素的影響不完全一致，可見，乙醇濃度和液料比有交互作用。這是因為多酚得率受料液比影響較大，料液比增加所提升的多酚得率削弱了乙醇濃度變化時所引起的多酚得率的降低。對比于超聲時間和料液比(圖4D)，超聲溫度和料液比(圖4E)，在圖4(A)中，料液比和乙醇濃度對多酚得率均有較明顯的影響，在圖4(D、E)中，料液比的影響分別大于超聲時間和超聲溫度，同時，料液比與超聲時間、超聲溫度有交互作用。觀察圖4(B)和圖4(F)，可以看出超聲時間對多酚得率的影響很小，超聲溫度的影響大于超聲時間，乙醇濃度的影響大于超聲時間。從圖4(C)中看出，多酚得率隨超聲溫度和乙醇濃度的變化均為先增加后降低，這與回歸方程中AD 項的系數是正號相一致。

通過響應面等一系列分析，得出最優工藝為:乙醇濃度35.38%，料液比1∶40，超聲時間20 min，超聲溫度46.44 ℃，考慮到實際操作，修正為:乙醇濃度35%，料液比1∶40，超聲時間20 min，超聲溫度46℃。總多酚得率的理論值為8.12986%。此工藝耗時較短、所用乙醇濃度低、高效節能，所以有較好的實際價值。

在此最優條件下，進行三次驗證試驗，所得結果分別為:8.11632%、8.10443%、8.12906%，平均值8.11660%，RSD 為0.15%，可見響應面法建立的回歸模型具有可靠性，最優工藝可行。

3 結論

本文以貫眾為原料，乙醇為溶劑，采用超聲提取法，通過單因素試驗和響應面法實驗設計，得出貫眾多酚得率的最優提取工藝為:乙醇濃度35%，料液比1∶40，超聲時間20 min，超聲溫度46 ℃，總多酚得率可達8.12986%，經平行試驗驗證，相對誤差很小。說明模型模擬較好，該提取工藝穩定可行。本實驗中，多酚得率較高，提取工藝簡單、快速，這為后續進一步開發研究貫眾有很大的實際意義。

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