HPLC 法測定青海栽培與野生桃兒七中2 種木脂素類的含量

李艷玲，徐文華，周國英，劉何春，陳 晨，宋文珠

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;2 中國科學院大學，北京 100049

桃兒七［Sinopodophyllum hexandrum (Royle)Ying］是小檗科(Berberidacea)桃兒七屬(Sinopodophyllum Ying)多年生草本植物。主要分布于我國中部從陜西太白山區由北向南沿橫斷山脈兩側的中高山及青藏高原地帶，海拔在1500～4500 m［1］。全株均可入藥，具有活血化瘀、解毒、抗氧化等功效［2，3］。現在人們主要是利用其有效成分——木脂素類物質，包括鬼臼毒素、4'-去甲基鬼臼毒素等，主要存在于桃兒七的根及根莖中，具有抗腫瘤作用［4］。近年來由于其鬼臼毒素等活性成分藥用價值的研究開發，市場需求量急劇增加，加之桃兒七生長周期長、繁殖率低等生物特性造成自然界桃兒七種群數量急劇減少，已面臨瀕危。引種栽培是緩解桃兒七瀕危現狀的重要方法之一。

目前鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素的提取工藝主要有CO2超臨界萃取法、甲醇回流-水-氯仿純化法、柱層析法、超聲提取等，由于超聲技術的優點是可以大幅度的提高有效成分的提取率，提取時間短，節省溶劑，操作簡便，且能在常溫下進行，可以避免高溫操作對有效成分的破壞［5］，故本實驗采用超聲法提取青海栽培與野生桃兒七植株內鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素，應用高效液相色譜法(HPLC)對其含量進行測定及對比分析，旨在能為其栽培植株的擴大生產及開發利用提供一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

美國Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);KQ5200DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);AG204 電子分析天平(梅特勒公司)。

鬼臼毒素標準品(批號:111645)和4'-去甲基鬼臼毒素標準品(批號:111792)購自中國藥品生物制品檢定所，純度均大于99.2%;甲醇(分析純，山東禹王實業有限公司化工分公司);乙腈(色譜純，山東禹王實業有限公司化工分公司);無水乙醇(分析純，山東禹王實業有限公司化工分公司);自制超純水。

1.2 HPLC 分析條件

Agilent Eslipse XDB C18(4.6 ×250 nm，5 μm)色譜柱，以V(乙腈)∶V(水)=27∶73 為流動相，流速:1.0 mL ∕min;進樣量:10.0 μL，柱溫:25 ℃，檢測波長:290 nm，采集時間25 min。

1.3 樣品來源

實驗樣品栽培植株采自青海省海東地區樂都縣馬營鄉桃兒七人工種植基地，野生植株采自樂都縣下北山林場林區，經中國科學院西北高原生物研究所徐文華副研究員鑒定為小檗科桃兒七屬植物桃兒七［Sinopodophyllum hexandrum (Royle)Ying］。于2012年7 月中旬植物生長旺季進行采樣，在種植基地和下北山林場林區分別采集30 株完整的桃兒七植株，隨機選取20 株，將樣品植株洗凈后用去離子水沖洗兩遍，植株自然陰干后，野生植株分為根狀莖、側根、葉柄、葉和果實5 部分;栽培植株由于植株生長年限短，未達到性成熟，不能形成果實，故僅分為根、葉柄和葉3 部分。樣品分別粉碎，過60 目篩后備用。

1.4 測定方法

1.4.1 對照品溶液制備

精密稱取鬼臼毒素標準品1.3 mg、4'-去甲基鬼臼毒素標準品2.0 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，用分析甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻，配制成濃度分別為0.13 mg/mL 和0.20 mg/mL 的單一標準品溶液。

1.4.2 供試品溶液制備

各樣品粉末各取約0.5 g，精確稱取，置于具塞錐形瓶中，準確加入10 mL 甲醇，在45 ℃、120 W 條件下進行超聲處理40 min，過濾后，殘渣加入10 mL甲醇重復提取，共3 次，將3 次濾液合并于25 mL 容量瓶中，冷卻后定容，搖勻經0.45 nm 微孔濾膜過濾后即為供試樣品溶液，3 次重復。

1.4.3 線性關系分析

圖1 對照品及樣品HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

將“1.4.1”項下制備所得單一標準品溶液經0.45 nm 的微孔濾膜過濾后，吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 μL，分別注入高效液相色譜儀，按照“1.2”項所述色譜條件分別測定鬼臼毒素、4'-甲基鬼臼毒素的峰面積，對2 種對照品溶液以色譜峰面積A 和進樣量C(μL)進行線性回歸，得到鬼臼毒素回歸方程為:A=50.870C-2.4，相關系數r=1;4'-去甲基鬼臼毒素回歸方程為:A=122.65C-14.357，相關系數r=0.9999。結果表明鬼臼毒素在0.26～1.82 μg 間具有良好的線性關系，4'-去甲基鬼臼毒素在0.40～2.80 μg 間具有良好的線性關系。鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素標準品高效液相色譜圖分別見圖1(A)、(B)。

1.4.4 精密度試驗

分別精密吸取2 種對照品溶液10 μL，重復5次，進行精密度試驗測定。得鬼臼毒素峰面積的RSD 為1.63%，4'-去甲基鬼臼毒素峰面積的RSD為0.82%，表明該方法精密度良好。

1.4.5 重現性試驗

精密稱取同一批樣品，按照上述樣品溶液制備方法進行重復性試驗，得到5 份供試樣品溶液，分別對其進行含量測定，得到鬼臼毒素峰面積的RSD 為1.13%，4'-去甲基鬼臼毒素峰面積的RSD 為0.96%，表明該方法重現性良好。

1.4.6 穩定性試驗

取供試樣品溶液在0、3、6、9、12 h 后分別進行測定，得鬼臼毒素峰面積的RSD 為0.74%，4'-去甲基鬼臼毒素的RSD 為0.53%，表明該方法穩定性良好。

1.4.7 加樣回收試驗

精密稱取0.2 g 已知鬼臼毒素含量的樣品(含量0.14%)，分別準確加入1.0、2.0、3.0 mL 的鬼臼毒素對照品溶液，按“1.4.2”項下方法制備成供試品溶液，測定含量，重復5 次，計算平均回收率;精密稱取2.0 g 已知4'-去甲基鬼臼毒素含量的樣品(含量0.02%)，分別準確加入1.0、2.0、3.0 mL 的4'-去甲基鬼臼毒素對照品溶液，按“1.4.2”項下方法制備成供試品溶液，測定含量，重復5 次，計算平均回收率。結果鬼臼毒素的平均回收率為99.46%，RSD=1.12%，4'-去甲基鬼臼毒素的平均回收率為99.08%，RSD=2.24%。

2 結果與分析

2.1 樣品中鬼臼毒素、4'-去甲基鬼臼毒素含量測定

按“1.2”項所述色譜條件進行供試樣品溶液的測定，在290 nm 條件下記錄鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素的HPLC 色譜圖，其中栽培桃兒七根及野生桃兒七的根狀莖和側根的色譜圖見圖1(C、D、E)。計算活性成分含量，并運用SPSS 20.0 對同種類型植株不同部位2 種木脂素類成分的含量進行多重比較，兩種類型植株不同部位鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素含量測定結果分別見表1 和表2。每個樣品做3 個平行樣。

表1 樣品中鬼臼毒素含量的測定結果Table 1 Quantification results of podophyllotoxin in different parts of samples

表2 樣品中4'-去甲基鬼臼毒素含量的測定結果Table 2 Quantification results of 4'-demethylpodophyllotoxin in different parts of samples

2.2 不同部位鬼臼毒素含量比較

野生植株和栽培植株各個部位均含有鬼臼毒素，且各部位之間的鬼臼毒素含量差異較大，鬼臼毒素主要集中分布于根中。野生植株各部位鬼臼毒素的含量由高到低依次為:側根＞葉柄＞根狀莖＞葉＞果實。其中依據鬼臼毒素的含量，這5 個部位可以分為三組，即側根、根狀莖與葉柄、葉與果實，這三組之間的鬼臼毒素含量呈顯著性差異，組內之間的鬼臼毒素含量差異不顯著。側根的鬼臼毒素含量最高，高達1.05%，是其它部位的6.2～35.0 倍。栽培植株各部位鬼臼毒素的含量由高到低依次為:根＞葉柄＞葉，各部位之間的鬼臼毒素含量均成顯著性差異。根中的鬼臼毒素含量最高，達0.80%，是其它部位的3.0～11.4 倍。

可以看出鬼臼毒素在青海栽培和野生桃兒七植株內不同部位的分布均符合根＞葉柄＞葉，這與馬紹賓(1997年)和白亞民(1988年)研究的關于野生桃兒七各器官鬼臼毒素含量的測定結果基本吻合［6，7］。由以上結果可以看出鬼臼毒素在桃兒七植株體內的分布由根到果實，鬼臼毒素的含量逐漸減少，這與生產上常于8～10 月份挖取其根及根狀莖進行有效成分的提取和藥品加工相符合［8］。

2.3 不同類型植株不同部位鬼臼毒素含量比較

栽培植株的葉柄和葉中鬼臼毒素的含量均比野生植株的含量高，其中栽培植株葉柄中鬼臼毒素的含量比野生植株高0.10%，是野生植株鬼臼毒素含量的1.6 倍;葉中鬼臼毒素的含量比野生植株高0.02%，是野生植株鬼臼毒素含量的1.4 倍。野生植株和栽培植株根中的鬼臼毒素含量在此實驗中無法直接比較，但可以看出，栽培植株根中鬼臼毒素的含量也很高，結合葉和葉柄(莖)的含量，栽培植株在一定程度上可以替代野生植株進行鬼臼毒素方面的藥品加工與制作從而滿足醫藥市場的需求，進而緩解野生桃兒七的瀕危現狀。

2.4 不同部位4'-去甲基鬼臼毒素含量比較

桃兒七植株中4'-去甲基鬼臼毒素的含量在各個部位之間的含量差異較大。野生植株各部位4'-去甲基鬼臼毒素的含量由高到低依次為:側根＞葉柄＞根狀莖＞葉，果實中未檢測到4'-去甲基鬼臼毒素。側根、葉柄與根狀莖、葉三組之間4'-去甲基鬼臼毒素的含量呈顯著性差異，葉柄和根狀莖之間4'-去甲基鬼臼毒素的含量差異不顯著。側根中4'-去甲基鬼臼毒素含量最高，達0.06%，是其它部位的2.0～3.0 倍。除果實未檢測到4'-去甲基鬼臼毒素外，4'-去甲基鬼臼毒素在野生植株各部位之間的分布與鬼臼毒素的分布特點基本相同，均為側根＞葉柄＞根狀莖＞葉。栽培植株各部位4'-去甲基鬼臼毒素的含量表現為葉柄＞根，葉中未檢測到4'-去甲基鬼臼毒素，這與栽培植株各部位鬼臼毒素含量的分布特點有所不同。

2.5 不同類型植株不同部位4'-去甲基鬼臼毒素含量比較

栽培植株葉柄中4'-去甲基鬼臼毒素的含量比野生植株高0.06%，是野生植株葉柄中4'-去甲基鬼臼毒素含量的3 倍。二者根中4'-去甲基鬼臼毒素的含量在此無法直接比較，但可以看出栽培植株根中4'-去甲基鬼臼毒素的含量也比較高，介于野生植株側根和根狀莖中4'-去甲基鬼臼毒素的含量之間。野生植株葉中4'-去甲基鬼臼毒素的含量比較低，僅為0.01%，栽培植株葉中未檢測到此物質。4'-去甲基鬼臼毒素在栽培植株和野生植株各部位的分布不甚相同，可能是由于受生長環境的不同和人工種植的影響而有所差異。

鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素均屬于木脂素類物質，是植物的次級代謝產物。鬼臼毒素具有高效抗癌活性，是合成抗癌藥物VP-16、VM-26 等藥物的前體物質。此實驗中栽培植株葉柄中這2 種木脂素類成分的含量比野生植株的含量高，可能是受自然生長條件的影響。光照、溫度、海拔、水等環境因素通過調節植物的生長發育影響有效成分的含量，使得同一時期不同地理條件下相同物種活性成分的含量也會出現較為明顯的差異［9］。并且鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素作為次級代謝產物，可能對植株主要起保護作用，在一定程度上與環境條件的優良成反比，即在環境越適宜植株生長的條件下含量可能越低，反之越高［10］。桃兒七適宜生長在山坡林下陰濕的地方，適宜在水分充足的條件下生存，此實驗中可能是由于人工栽培地屬于陽坡，蓄水能力較差，且光照比較強烈，對桃兒七的生長有一定的環境脅迫，從而使得栽培植株鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素的含量相對較高。

3 結論

青海栽培與野生桃兒七植株鬼臼毒素在其不同部位的含量分布均表現為:根＞葉柄＞葉＞果實，除了根的含量無法具體比較外，栽培植株葉柄和葉中鬼臼毒素的含量均大于野生植株。4'-去甲基鬼臼毒素在這2 種類型植株各部位的分布則有所不同，栽培植株葉柄中4'-去甲基鬼臼毒素的含量高于野生植株，是野生植株含量的3 倍，野生植株葉中雖檢測到4'-去甲基鬼臼毒素，但其含量甚微，所以綜合考慮鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素，在這兩種木脂素類成分的提取和藥品加工上，栽培植株在一定程度上可以替代野生植株，從而緩解野生植株的瀕危現狀。

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