近紅外漫反射技術測定烤煙煙葉中的茄尼醇

付秋娟，杜詠梅*，張懷寶，侯小東，李燕華，李丹丹

1中國農業科學院煙草研究所，青島 266101;2 山東京魯煙葉復烤有限公司，濰坊 262200

茄尼醇(Solanesol)是重要的生物活性物質中間體，是泛醌類藥物中間體不可替代的成分，即輔酶Q10 和維生素K 的側鏈，在治療心血管系統疾病［1］、癌癥［2］和肝病［3］等方面有獨特的療效。煙草是茄尼醇含量最高的植物，也是目前提取茄尼醇的主要原料。茄尼醇分子量大，沸點高，液相色譜法是目前煙草茄尼醇檢測最主要的方法。由于茄尼醇在煙草體內以游離態和化合態(主要以乙酸酯、棕櫚酸酯、亞油酸酯)兩種形式存在，煙草總茄尼醇的提取需經過復雜的皂化、萃取過程［4-10］，方法繁瑣，步驟復雜，測定周期長，檢測效率低，不利于批量操作，且消耗大量有機溶劑，因此建立一種高效的總茄尼醇(下述中的茄尼醇均指總茄尼醇)檢測方法，對于煙草茄尼醇資源的快速篩選具有重要意義。

近紅外光譜具有分析速度快、樣品前處理簡單、低消耗、多組分同時測定和適合在線檢測等諸多優點，成為近年來發展最快、引人注目的一門獨立的分析技術。本研究首次利用近紅外漫反射光譜技術建立了烤煙煙葉中總茄尼醇的定量分析模型，對煙葉中的茄尼醇進行快速準確的測定。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器

2010～2011年，在我國主要烤煙生產省份(云南、貴州、四川、重慶、湖南、湖北、福建、廣西、山東、河南、黑龍江、遼寧、吉林、陜西)，分別選取1～6 個代表產地，每產地選取一套等級(B2F、C3F、C3L、X2F)代表樣品，共選取樣品243 份。用其中80%(193 個)的樣品作為建模樣品集(校正集)，20%(50 個)作為驗證樣品集(驗證集)和轉移樣品(表1)。

Aataris II FT-NIR 光譜儀(Thermo Fisher 公司)，配有積分球漫反射采樣系統，Result 操作軟件，TQ Analyst 8.0 分析軟件;超高效液相色譜儀(Waters，H-Class)，KQ-500GVDV 型恒溫超聲器(上海昆山)，Sartorius 電子天平(精度0.0001 g)，立鶴牌302 型烘箱(山東濰坊)，SY-Ⅲ型實驗用切絲機(河南富邦實業有限公司)。

表1 校正集和驗證集茄尼醇含量分布Table 1 Content distribution of solanesol in calibration and validation set

1.2 研究方法

1.2.1 樣品制備

由外觀鑒定專家根據GB2623-92《烤煙》對選擇樣品進行等級平衡、鑒定及品質評價后，選取代表等級煙葉3～5 kg，去筋，切絲(0.9±0.1 mm)，混勻，取100 g 煙絲放入烘箱內，60 ℃烘干后制成粉末(60目)，進行近紅外光譜采集。

1.2.2 茄尼醇化學值的測定

稱取煙草粉末樣品0.1 g(精確至0.0001 g)，放入20 mL 帶有聚四氟乙烯密封蓋的離心玻璃管中，用移液管加入1.0 mL 的氫氧化鈉乙醇(0.1 moL/L)溶液及5.000 mL 正己烷溶液，蓋上密封蓋，振蕩，混勻，放入恒溫超聲提取器中，在超聲頻率45 KHz，溫度40 ℃條件下，提取30 min，取出，冷卻至室溫，旋開密封蓋，加入8 mL 去離子水，蓋緊瓶蓋，充分振蕩后，放入離心機，3000 rpm，離心10 min 取出，用移液槍移取0.500 mL 離心管中上層正己烷茄尼醇提取液，流動相稀釋至5.000 mL，用0.22 μm有機濾膜過濾至液相色譜安培瓶中，應用超高效液相色譜(UPLC)進行檢測。

色譜條件:色譜柱:BEH C18(1.7 μm，2.1 ×100 mm)，流動相:甲醇∶乙腈=50 ∶50，流速:0.5 mL/min，柱溫:35 ℃，檢測波長:210 nm。茄尼醇液相色譜圖見圖1。

該方法為本實驗室開發(ZL201310282917.0)，試驗的加標回收率范圍為93.4%～102.3%，RSD范圍為1.61%～2.43%，方法精密度RSD 為2.49%，回收率和精密度較高，符合定量分析要求。

圖1 茄尼醇液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of solanesol

1.2.3 近紅外光譜采集

取煙葉樣品粉末20 g 置石英測量杯中，加上壓樣器，放在旋轉臺內進行光譜采集。采集條件:以儀器內置背景為參比，波數范圍:10000～3800 cm-1，掃描次數:64 次，分辨率:8 cm-1。實驗室溫度控制在20～24 ℃。

1.2.4 定量校正模型的建立

應用TQ Analyst 8.0 分析軟件中的偏最小二乘(PLS)回歸算法，把采集的近紅外漫反射光譜數據與化學方法測定的茄尼醇的化學值，采用留一(leave-one-out)交叉驗證法建立校正模型，并進一步優化驗證，以校正模型的相關系數(R)、校正均方差(RMSEC)、交叉驗證均方差(RMSECV)、預測均方差(RMSEP)等指標來考察模型的建模效果，所有參數的計算方法見文獻［11，12］。通常相關系數越接近100%，均方差越小，表示模型的預測值越接近化學值，擬合效果越好。模型建立以后，用外部驗證來檢驗模型的預測能力。

1.2.5 模型傳遞

分別采用無標轉移和有標轉移兩種方法進行模型傳遞，無標轉移是將模型直接傳遞到其他儀器上;有標轉移是先將轉移樣品的一部分添加在待轉移儀器模型上，重新計算模型，得到一個新模型，然后用其他轉移樣品考察新模型的預測效果。

2 結果與分析

2.1 不同預處理方法對校正模型的影響

近紅外光譜在采集過程中，為了消除樣品的顆粒大小、裝樣條件、儀器條件等影響而產生的光譜基線漂移和偏移及信噪比降低等問題，通常采用平滑和求導的方法進行數學預處理［13］。表2 為分別采用原始光譜、一階導數和二階導數光譜建立模型時的相關系數(R)、交叉驗證均方差(RMSECV)、預測均方差(RMSEP)。結果表明，茄尼醇模型采用一階導數，Savitzky Golay 平滑建模時，得到了較低的交叉驗證均方差(RMSECV)。二階導數雖然取得了較高的相關系數，但交叉驗證過程中均方差(RMSECV)和預測均方差(RMSEP)均較高，結合主因子數考察發現模型有“過擬合”現象。因此光譜預處理選擇一階導數，Savitzky Golay 平滑建立了茄尼醇的定量校正模型。

表2 不同預處理方法對校正模型RMSECV 的影響Table 2 Effect of different pretreatment methods on the correction model of RMSECV

2.2 譜區范圍選擇對校正模型的影響

表3 為使用不同譜區的光譜信息建立校正模型時的相關系數R 和均方差RMSECV 值，其中譜區10000～4000 cm-1為全譜區，括號內數字為PLS 主因子階數。從表3 數據可以看出，譜區范圍的選擇對定量分析精度影響較大。茄尼醇模型采取一階導數預處理并用不同譜區范圍建立的模型中，以7836.02～3893.62 cm-1建立校正模型的均方差RMSECV(0.121)最小，因此選擇7836.02～3893.62 cm-1譜區作為茄尼醇模型的最佳建模譜區。

表3 不同譜區范圍對RMSECV 的影響Table 3 Effect of different spectral range on RMSECV

2.3 模型的優化與外部驗證

基于前述得到的建模參數，即建立了茄尼醇的定量分析校正模型。然后對模型進一步優化，通過判斷和剔除異常樣品(Outlier)和強影響點［14］，確定最優主因子，獲得了茄尼醇的最佳校正模型，模型交叉驗證均方差RMSECV 為0.108。優化后模型的各項參數見表4，NIR 預測值與化學值的散點圖見圖2。

表4 茄尼醇校正模型的數理指標Table 4 Statistics results for calibration models

圖2 茄尼醇的化學值與模型預測值的散點圖Fig.2 Scatter plot of NIR predicted and chemical value

為了檢驗模型的預測能力，通常選用一批未參與建模的樣品對模型進行外部驗證，本文用前述的50 個驗證集樣品對模型進行預測，通過預測值和化學值的內部交叉驗證均方差(RMSECV)和預測均方差(RMSEP)檢驗模型的預測能力。從茄尼醇預測模型的預測值和化學值散點圖和相關圖(圖2、圖3)看出，NIR 預測值能夠很好的逼近標準值，達到較低的預測均方差和相對偏差，其RMSEP 為0.0822，化學值和NIR 預測值的平均相對偏差為5.3%。利用DPS v7.05 統計分析軟件，通過配對t 檢驗進一步驗證發現，P 值(雙尾)為0.831，大于0.05，說明化學方法和近紅外速測兩種方法不存在顯著差異，即沒有系統誤差，模型具有很好的預測能力。

圖3 模型預測值和化學值的相關圖Fig.3 Correlogram between model predicted values and chemical values

2.4 模型傳遞

50 個轉移樣品分別用無標轉移(即直接轉移)和有標轉移法將模型轉移到另一臺近紅外儀器(從儀器)上，“從儀器”與“主儀器”型號相同，均為Aataris II FT-NIR 光譜儀(Thermo Fisher 公司)。無標轉移和有標轉移模型效果圖見圖4，從圖4 看出無標轉移法中“從儀器”光譜產生了較大的系統偏差，轉移樣品產生較大偏離，造成模型的預測均方差較大，無標轉移效果不是很理想，因此考慮采用有標轉移法。將50 個轉移樣品中的10 個添加到“從儀器”的模型里，重新計算模型，得到了“從儀器”的模型，轉移模型的相關系數及預測均方差見表5，由表5 和圖4 可知，雖然兩種轉移方法“主儀器”和“從儀器”模型的各項參數接近，但有標轉移模型的預測均方差RMSEP(0.114)更低，轉移效果更佳，模型成功地轉移到“從儀器”上。

圖4 模型轉移效果圖Fig.4 Model transfer renderings

表5 轉移模型無標轉移和有標轉移的各項參數Table 5 Parameters of calibration transfer without standard sample and calibration transfer with standard sample

3 結論

選取具有代表性的建模樣品，采用一階導數預處理光譜，選擇7836.02～3893.62 cm-1譜區建立了較高準確性的茄尼醇近紅外預測模型，模型內部交叉驗證均方差(RMSECV)為0.108，外部驗證的預測均方差(RMSEP)為0.0822，平均相對偏差為5.3%，結果表明近紅外預測值與化學值結果較為一致。并通過有標轉移法成功地將模型轉移到其它儀器上，實現了不同實驗室對批量樣品的快速檢測，同時也為篩選高含量茄尼醇品種提供了快速有效的方法。

1 Niibori K，Yokoyama H，Crestanello JA，et al.Acute administration of liposomal coenzyme Q10 increases myocardial tissue levels and improves tolerance to ischemia reperfusion injury.J Surg Res，1998，79:141-145.

2 Portakal O，Ozkaya O，Erden Inal M，et al.Coenzyme Q10 concentrations and antioxidant status in tissues of breast cancer patients.Clin Biochem，2000，33:279-284.

3 Portakal O，Inal-Erden M.Effects of pentoxifylline and coenzyme Q10 in hepatic ischemia/reperfusion injury.Clin Biochem，1999，32:461-466.

4 Severson RF，Ellington JJ，Schlotzhauer PF，et al.Gas chromatographic method for the determination of free and total solanesol in tobacco.J Chromatogr A，1977，139:269-282.

5 Tao YH(陶云海)，Ren ZY(任周陽)，Liu GQ(劉國清)，et al.Extract and quantitative determination of solanesol from discarded tobaco in Yunnan province.J Yunnan Univ，Nat Sci (云南大學學報，自科版)，2002，24:151-152.

6 Tong KQ(童康瓊)，Lan MR(蘭明蓉)，Zhao YF(趙云飛)，et al.Determination of total solanesol in tobacco leaf with HPLC.Tobacco Sci Tech (煙草科技)，2008，248(3):49-52.

7 Sun YH(孫銀合)，Huang RL(黃仁亮)，Xing XX(邢肖肖)，et al.Enhanced extraction of solanesol from tobacco leaves by a new ammonia leaching pretreatment method.Fine Chem(精細化工)，2013，30:32-35.

8 Pan W(潘葳)，Liu WJ(劉文靜)，Weng BQ(翁伯琦)，et al.Determining solanesolin in tobacco leaves and its extracts using HPLC standardized method.Chin Tob Sci(中國煙草科學)，2013，34(4):60-66.

9 Zhang J(張婕)，Wang YS(汪云松)，Cai K(蔡凱)，et al.Determination of solanesol content in tobacco leaves by using ultra-high pressure liquid chromatography.Chin Tob Sci (中國煙草科學)，2013，33(6):80-84.

10 Yang J(楊靖)，Li RL(李瑞麗)，Sun ZT(孫志濤)，et al.Study on the technology of supercritical CO2extraction solanesol from tobacco leaves.Food Ind(食品工業)，2012，33(8):35-38.

11 Yan YL(嚴衍祿).Near Infrared Spectrum Analysis and Application(近紅外光譜分析基礎與應用).Beijing:China Light Industry Press，2005.169-174.

12 Blanco M，Coello J，Iturriaga H，et al.NIR calibration in nonlinear systems:different PLS approaches and artifical neural networks.Chemom Intell Lab Syst，2000，50:75-82.

13 Bai Y(白雁)，Li XQ(李小慶)，Lei JW(雷敬衛).Rapid determination of paeoniflor in Paeoniae Radix Alba by nearinfrared spectroscopy.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2013，25:358-362.

14 Wang JJ(王家俊)，Liang YZ(梁逸曾)，Wang F(汪帆).Simultaneous determination of tar，nicotine and carbon monoxide in smoking by partial least squares and fourier transform near infrared transmission spectrometry.Chin J Anal Chem (分析化學)，2005，33:793-797.