UPLC-MRM-MS 法測定頭花蓼藥材中7 個指標成分

劉 躍，胡 杰，謝玉敏，黃 勇，廖尚高，鄭 林

1貴陽醫學院 藥學院 貴州省藥物制劑重點實驗室;2 貴陽醫學院 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴陽 550004

頭花蓼又名四季紅、石莽草等，為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don 的干燥全草或地上部分，在《苗族醫藥學》、《中華本草·苗藥卷》、《貴州植物志》、2003 版《貴州省中藥、民族藥質量標準》中均有收載，現廣泛用于治療泌尿系統感染，泌尿系統結石，急、慢性尿道炎等泌尿系統疾病［1］。目前，以頭花蓼為原料藥已開發并上市了熱淋清顆粒、寧泌泰膠囊、四季草顆粒等各種單復方苗藥制劑。據文獻報道，頭花蓼的化學成分主要包括揮發油、黃酮類及酚酸類等化合物［2-6］，其藥理活性研究表明，其內含有的酚酸及黃酮類具有一定的抗氧化活性，為頭花蓼的主要藥效成分［7-9］。

2003 版《貴州省中藥、民族藥質量標準》中僅收錄用高效液相法測定槲皮素這一單一成分，盡管目前已有不少學者對頭花蓼當中的沒食子酸、槲皮苷及槲皮素等成分進行了含量測定［10，11］，以多指標成分對頭花蓼藥材進行全面質量評價尚未報道。基于此，本文以沒食子酸、原兒茶酸、楊梅苷、陸地棉苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-(2″-沒食子酰基)-鼠李糖苷、槲皮素及兒茶素這7 個成分為檢測指標，應用專屬性強，靈敏度高，快速準確的UPLC-MRM-MS 法對頭花蓼藥材進行全面的含量測定，進一步為頭花蓼及其相關制劑質量評價及其資源的綜合開發、利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號0752-9605，純度≥98%)，沒食子酸(中國固體制劑制造技術國家工程研究中心，批號M20-101209，純度≥98%)，原兒茶酸、楊梅苷(四川省維克奇生物科技有限公司，批號110306，111018，純度≥98%)，陸地棉苷、槲皮苷、槲皮素-3-O-(2″-沒食子酰基)-鼠李糖苷、槲皮素及兒茶素實驗室自制(采用1H NMR、13C NMR、MS、UV、IR 波譜進行結構鑒定，用UPLC-PDA 在多個檢測波長下測定，其峰面積歸一化結果均大于98)，甲醇(天津科密歐化學試劑有限公司)、乙腈(德國Merck 公司)為色譜純，其余溶劑均為分析純，水為超純水。頭花蓼藥材:共6 批樣品，來源于貴州施秉頭花蓼GAP 基地及貴州主要產地，由貴陽醫學院龍慶德副教授鑒定為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草。

1.2 儀器設備

ACQUITY 系統超高液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀(美國Waters 公司，包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質譜分析器和Masslynx4.1 質譜工作站)。

2 實驗方法

2.1 標準溶液的配制

對照品溶液:精密稱取沒食子酸等7 種對照品適量，分別置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。得沒食子酸(1.073 mg/mL)、原兒茶酸(0.974 mg/mL)、陸地棉苷(0.690 mg/mL)、槲皮苷(1.020 mg/mL)、兒茶素(0.902 mg/mL)、槲皮素-3-O-(2″-沒食子酰基)-鼠李糖苷(0.540 mg/mL)及槲皮素(1.010 mg/mL)的對照品儲備液。分別精密量取沒食子酸等七種對照品儲備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標準溶液。置冰箱(-20 ℃)保存，備用。

內標溶液:精密稱取葛根素10.33 mg，用甲醇定容至25 mL，獲得葛根素0.413 mg/mL 的儲備液。取內標儲備液適量至5 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 μg/mL 的內標溶液，置冰箱(-20℃)保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備

取本品細粉約0.5000 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，稱定重量(精確至0.01 g)，置水浴中加熱回流1 h，放冷，稱重，用提取液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續濾液5 mL 至25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)柱，保護柱:Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm);流速:0.35 mL/min;柱溫:45 ℃;進樣體積為1 μL;流動相:0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);梯度洗脫程序如下:0～1.5 min，5%～30%(A);1.5～3 min，30%～90%;3～4 min，90%;4～5 min，90%～5%。

2.4 質譜條件

采用電噴霧電離源(ESI)，毛細管電離電壓3 kV，離子源溫度120 ℃;去溶劑氣N2，流速650 L/h，去溶劑氣溫度350 ℃;碰撞氣Ar，流速0.16 mL/min。掃描方式為多反應離子監測(MRM)，監測離子見表2。

表1 多反應離子檢測質譜條件Table 1 MRM analysis parameters for the 7 targeted compounds

注:分析物1～7 分別為沒食子酸、原兒茶酸、陸地棉苷、槲皮苷、兒茶素、槲皮素-3-O-(2″-沒食子酰基)-鼠李糖苷及槲皮素.Note:Analyte 1-7 are gallic acid，protocatechuic acid，que-3-O-β-D-Glc，quercitrin，catechin，que-3-O-(2″-O-galloyl)-β-D-Glc and quercetin，respectively.

3 實驗結果

3.1 專屬性試驗

精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液適量并分別加入內標(葛根素)溶液，15000 rpm 離心5 min，取上清液分別進樣，結果見圖1。由此結果可看出成分間分離良好，未見雜質干擾，供試品溶液中被測成分與7 個對照品的保留時間相同，通過比較被測定成分和對照品的母離子、子離子質譜圖，兩者一致，表明本法專屬性良好。

圖1 混合對照品溶液(A)和供試品溶液(B)的UPLC-MRM-MS 圖譜Fig.1 UPLC-MRM-MS chromatogram of reference substances (A)and sample (B)

3.2 線性試驗

精密吸取“2.1”項下制備的混合對照品溶液適量，依次稀釋，制得6 個濃度的系列濃度線性工作液，分別進樣測定。以待測物的峰面積與內標峰面積之比(A/Ai)為縱坐標Y，各物質濃度(C)為橫坐標X 進行直線回歸，權重系數為1/X，求得直線方程，即為標準曲線。回歸方程見表2。

表2 7 種成分的線性關系Table 2 Linear relationships of 7 components

3.3 重復性試驗

取同批次頭花蓼藥材，按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在UPLC-MRM-MS 條件下分別進樣測定，根據內標法計算沒食子酸、原兒茶酸、陸地棉苷、槲皮苷、兒茶素、槲皮素-3-O-(2″-沒食子酰基)-鼠李糖苷及槲皮素的平均含量分別為1.276、0.179、0.041、1.326、0.069、0.061 及2.681 mg/g，RSD 分別為1.07%、3.58%、1.43%、2.23%、2.62%、2.62%及2.59%，結果表明此方法重復性良好。

3.4 精密度試驗

取同一份供試品溶液，在相同條件下連續測定3 d，每天進樣6 次，根據內標法計算含量，結果7 種成分的日內和日間精密度(n=6)分別為0.92%～3.49%和1.21～4.41%，表明儀器精密度良好。

3.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別處理后于0、2、4、8、12、18、24 h 進樣分析，7 種成分的RSD 分別為1.03%、2.66%、1.83%、0.93%、2.95%、2.73%、3.23%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

3.6 加樣回收率試驗

精密稱取6 份已知含量的頭花蓼樣品0.5000 g，平均分為3 組，分別精密加入0.5、1.0、2.0 mL 混合標準溶液［沒食子酸、原兒茶酸、陸地棉苷、槲皮苷、兒茶素、槲皮素-3-O-(2″-沒食子酰基)-鼠李糖苷及槲皮素濃度分別為0.407、0.092、0.065、0.228、0.256、0.051、0.383 μg/mL］，制成低、中、高濃度的質控樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述條件進樣測定，計算加樣回收率，結果低、中、高濃度水平下原兒茶酸等7 種成分回收率分別為93.22%～100.32%、95.37%～102.68%、97.37%～102.11%、94.89%～103.35%、91.23%～104.35%、95.54%～ 103.12%、93.83%～105.33%。

3.7 樣品測定

按“2.2”項下方法制備6 批樣品的供試品溶液，處理后分別進樣測定，根據內標法計算樣品中各成分的含量，結果見表3。

表3 6 批樣品中7 個成分的含量(mg/g，n=3)Table 3 Determination of 7 components in six batches of P.capitatum sample (mg/g，n=3)

4 討論

2010年版《中國藥典》中對熱淋清顆粒的質量控制方法僅以沒食子酸為指標［12］，然而不同批次間沒食子酸含量略有差異，因此建立一種靈敏、快速、可靠的的定量分析方法以同時測定頭花蓼藥材中主要活性成分的含量是極其有必要的。

本研究采用UPLC-MRM-MS 系統建立了頭花蓼藥材中七個指標成分靈敏、快速、可靠的定量分析方法，5 min 即完成樣品的分析，顯著提高了定量分析的重復性和可靠性。從表4 的6 批頭花蓼藥材含量測定結果可看出原兒茶酸，陸地棉苷在不同批次藥材中含量較穩定，但含量較低，沒食子酸、槲皮苷、槲皮素含量較高，6 批藥材槲皮素的含量均符合2003版《貴州省中藥、民族藥質量標準》。經對不同產地的頭花蓼中7 種化學成分含量測定，表明本方法能達到有效分離各組分的目的，可作為頭花蓼的質量控制方法;同時表明不同地域的頭花蓼中3 種成分的含量存在明顯差異，說明生態環境、采收時間和儲存條件等可能對含量產生影響。上述結果提示，為保證頭花蓼相關制劑批次間質量的一致性，應加強頭花蓼的質量控制，必要時固定藥材的來源。

1 Editorial Office of National Chinese Herbal Medicine Collection(全國中草藥匯編編寫組).Collection of Chinese Herbal Medicine(全國中草藥匯編).Beijing:People’s Medical Publishing House，1992.

2 Li YJ(李勇軍)，Luo HF(駱洪峰)，Wang YL(王永林)，et al.Studies on the chemical constituents of flavonoids from Polygonum capitatum.Chin Pharm J(中國藥學雜志)，2002，35:3004.

3 Li YM(李詠梅)，Gong Y(龔元).The latest research progression for the chemical constituents and pharmacology of Polygonum capitatum.J Guizhou Univ，Nat Sci(貴州大學學報，自科版)，2007，24:205.

4 Liu ZJ(劉志軍)，Qi J(戚進)，Zhu DN(朱丹妮)，et al.Chemical constituents from Polygonum capitatum and their antioxidation activities in vitro.J Chin Med Mat(中藥材)，2008，31:995-998.

5 Yu M(于明)，Li ZL(李占林)，Li N(李寧)，et al.Chemical constituents of the aerial parts of Polygonum capitatum.J Shenyang Pharm Univ(沈陽藥科大學學報)，2008，25:633-635.

6 Yang Y(楊陽)，Cai F(蔡飛)，Yang Q(楊琦)，et al.Study on chemical constituents of Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don.Acad J Second Mil Med Univ(第二軍醫大學大學學報)，2009，30:937-939.

7 Li X，Yu M，Meng D，et al.A new chromone glycoside from Polygonum capitatum.Fitoterapia，2007，78:506-509.

8 Liao SG，Zhang LJ，Sun F，et al.Antibacterial and anti-inflammatory effects of extracts and fractions from Polygonum capitatum.J Ethnopharmacol，2011，134:1006-1009.

9 Zhao HX(趙煥新)，Bai H(白虹)，Li W(李巍)，et al.Chemical constituents from Polygonum capitatum.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2011，23:262-266.

10 Yang BB(楊蓓蓓)，Feng R(馮茹)，Wang WC(王維聰)，et al.Quantitative analysis of three active constituents in Miao regional herb，Polygonum capitatum by HPLC/DAD/MS.Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志)，2008，20:1793-1796.

11 Wu HM(吳紅梅)，He HY(賀祝英)，Wang XS(王祥森).Determination of gallic acid and quercitrin in Polygonum capitatum by HPLC.Lishizhen Med Mater Res(時珍國醫國藥)，2011，20:18-19.

12 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，11.