二十五味珊瑚丸對D-半乳糖衰老大鼠神經元特異性烯醇化酶表達的影響

楊 春 ，李 鵬，羅遠帶，杜以寬，黃福開*，甄麗芳，胡賢達，楊勤勞，原 林，4*

1深圳大學光電工程學院 光電子器件與系統(教育部/廣東省)重點實驗室，深圳 518000;2南方醫科大學，廣州 510515;3 中國藏學研究中心北京藏醫院，北京 100029;4 深圳大學醫學院，深圳 518060

阿爾茨海默病(又稱老年性癡呆，AD)是發生在老年及老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經退行性病變［1，2］。中醫理論認為AD 屬于“老年呆病”的范疇，其病理機制主要是本虛標實，本虛主要是腦髓虧虛，標實主要是痰濁、血瘀。目前治療AD 大都是針對其某一特定病理環節進行干預，但由于AD 發病機制復雜，單一作用點的藥物很難取得滿意的治療效果。而中藥治療AD多途徑、多靶點的特征，正契合了該病復雜多樣的發病機制。神經元及神經膠質細胞在神經退行性疾病發生中起著重要作用。在衰老及相關的神經退行性病變防治中，調節神經細胞的功能成為一種新的靶標。D-半乳糖致大鼠衰老模型是一種簡便優良的衰老模型，此模型神經元大量變性衰老。反應性星形膠質細胞增生參與了D-半乳糖誘導腦衰老的病理過程。二十五味珊瑚丸為藏藥名方，具有開竅、通絡和止痛的功效，對腦部神經血管病變具有較好的療效［3］。本實驗選用D-半乳糖制備衰老鼠模型，之后給予二十五味珊瑚丸干預，通過HE 染色觀察海馬區錐體細胞形態，通過NSE 免疫組化染色和Western blotting 法觀察海馬神經元特異性烯醇化酶(NSE)的表達情況，探討二十五味珊瑚丸對衰老鼠海馬細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備

成年SD 雄性大鼠18 只，體重180～220 g(No.4402101582);隨機分為模型組、對照組和二十五味珊瑚丸組，每組各6 只。模型組及二十五味珊瑚丸組頸背部皮下注射D-半乳糖500 mg/(kg·d)(溶于生理鹽水中)，對照組頸背部皮下注射生理鹽水，連續給藥8 周。于造模的第6 周，對照組、模型組給予生理鹽水灌胃，二十五味珊瑚丸組(根據前期結果采用最適濃度)給予二十五味珊瑚丸64 mg/(kg·d)(混于生理鹽水中)灌胃，連續給藥2 周。

1.2 腦組織切片的制備

灌胃4 周后，各組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，固定，暴露心臟，剪開右心耳，經左心室灌注生理鹽水，待肝臟顏色變淺，然后以4%的多聚甲醛灌注約60 min，先快后慢，待肝臟及尾巴變硬，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中固定，經PBS 緩沖液反復浸洗，最后將腦組織脫水，透明，石蠟包埋，冠狀切片(厚約5 μm)備用。

1.3 HE 染色及NSE 免疫組化染色

石蠟切片烤片(65 ℃，60 min);二甲苯脫蠟(2×10 min);經100%～50%酒精梯度脫水后入蒸餾水;蘇木素染色5 min;蒸餾水洗2 min;1%鹽酸乙醇1～3 s;流水沖洗30 min;0.5%伊紅液染色3 min;蒸餾水洗2 min;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Olympus 顯微鏡下觀察，并拍照收集海馬切面圖像。

石蠟切片烤片(65 ℃，60 min);二甲苯脫蠟(2×10 min);經100%～50%酒精梯度脫水后入蒸餾水;50%甲酰胺2 ×SSC，65 ℃2 h;2 ×SSC 洗5 min;2 mol/L HCl 37 ℃30 min，0.1 mol/L 硼酸室溫10 min;1% H2O2in PBS 10 min，1 ×PBS 洗3 ×10 min;5%山羊血清/0.3% tritonX-100 室溫封閉2 h;加1∶100 稀釋的兔抗鼠NSE 一抗4 ℃過夜，用PBS 代替一抗做陰性對照，PBS 漂洗(3 ×10 min);加入1∶200稀釋的辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG 二抗，37 ℃孵育，PBS 漂洗(3 ×10 min);加新配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察5～10 min;自來水充分沖洗;蘇木素復染;去離子水分化;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Olympus 顯微鏡下觀察，并拍照收集海馬切面圖像。采用Image pro Plus 6 圖像分析軟件，測量NSE 陽性細胞數。

1.4 Western blotting 分析NSE 表達

稱取各組大鼠海馬組織50 mg，液氮中研磨后，加入300 μL RIPA 細胞裂解液，冰上靜置30 min，4℃、13000 g 離心10 min，取上清，即為提取的海馬組織總蛋白。BCA 蛋白定量法計算出蛋白濃度。吸取50 μg 總蛋白，加入25%體積電泳上樣緩沖液，98℃加熱變性5 min。12% SDS-PAGE 分離膠，5%SDS-PAGE 積層膠電泳，上樣50 μg 總蛋白。電泳后將蛋白從SDS-PAGE 凝膠轉至PVDF 膜上。用5%的脫脂奶粉封閉1 h。TBS-T 洗脫三次，每次5 min。加一抗∶兔多克隆抗體NSE 以1 ∶500 稀釋。鼠多克隆抗體actin 以1∶1000 稀釋，4 ℃孵育過夜。次日室溫孵育30 min，TBS-T 洗脫三次，每次5 min。加二抗∶鼠抗兔二抗以1∶2000 稀釋，室溫孵育2 h，BeyoECL Plus 發光液顯影。Kodak Image Station 2000MM 成像系統采集圖像，獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool 3.0 分析，用NSE/Actin 代表NSE的相對表達量。

1.5 統計分析

數據分析采用SPSS 13.0 統計軟件處理，應用單因素方差分析，以均數±標準差()表示，P＜0.05 為有統計學差異。

2 實驗結果

2.1 各組大鼠海馬CA3 區HE 染色

海馬CA3 區主要為錐體細胞層，HE 染色后胞漿呈紅色，細胞核呈藍色;與對照組相比，模型組錐體細胞層細胞數量明顯減少，排列稀疏、紊亂，細胞間隙增大，可見核固縮;與模型組相比，二十五味珊瑚丸組錐體細胞丟失較少，細胞排列較緊密、整齊，結果見圖1。

圖1 對照組(A)、模型組(B)及二十五味珊瑚丸組(C)大鼠海馬CA3 區HE 染色(×400)Fig.1 H＆E staining of CA3 of blank control group (A)，aging model group (B)and 25 odors coral pills group (C)(×400)

2.2 各組大鼠海馬DG 區NSE 免疫組化染色

NSE 在各組大鼠海馬齒狀回區均有表達，主要分布在胞漿，為黃色或棕黃色顆粒物;與對照組相比，模型組NSE 陽性的細胞數量增多，胞體肥大，突起較粗;與模型組相比，二十五味珊瑚丸組NSE 陽性的細胞數量明顯減少，胞體較小，突起較細，結果見圖2。

圖2 對照組(A)、模型組(B)及二十五味珊瑚丸組(C)大鼠海馬區NSE 染色(×400)Fig.2 NSE expression of aging model group (A)，blank control group (B)and 25 odors coral pills group (C)(×400)

2.3 各組大鼠海馬區NSE 陽性細胞數和累積光密度

與對照組比較，模型組海馬各區的細胞數明顯增多，累積光密度值(IOD)明顯增大，差異有顯著性(P＜0.05);與模型組比較，二十五味珊瑚丸組各區的細胞數明顯減少，累積光密度值IOD 明顯減小，差異有顯著性(P＜0.05)，結果見表1 及表2。

表1 各組大鼠海馬區NSE 陽性細胞數比較(n=6，)Table 1 Comparison of the number of NSE positive cells in the hippocampus of rats (n=6，)

表1 各組大鼠海馬區NSE 陽性細胞數比較(n=6，)Table 1 Comparison of the number of NSE positive cells in the hippocampus of rats (n=6，)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05;與模型組比較，＊＊P＜0.05。Note:Compared with control group，* P＜0.05;Compared with aging model group，＊＊P＜0.05.

表2 各組大鼠海馬區NSE 陽性細胞累積光密度(IOD)比較(n=6，)Table 2 Comparison of the integrated optical density (IOD)for NSE in the hippocampus of rats (n=6，)

表2 各組大鼠海馬區NSE 陽性細胞累積光密度(IOD)比較(n=6，)Table 2 Comparison of the integrated optical density (IOD)for NSE in the hippocampus of rats (n=6，)

注:與空白對照組比較，* P＜0.05;與模型組比較，＊＊P＜0.05。Note:Compared with control group，* P＜0.05;Compared with aging model group，＊＊P＜0.05.

2.4 Western blotting 分析各組大鼠海馬NSE 表達

與對照組比較，模型組NSE 蛋白表達有增高趨勢，差異有顯著性(P＜0.05);與模型組相比，二十五味珊瑚丸組NSE 蛋白表達有下降趨勢，差異有顯著性(P＜0.05)，結果見圖3。

圖3 各組大鼠海馬NSE 表達(Western blotting 分析)Fig.3 Expression of NSE in different groups (Western blotting and densitometric analysis)

3 討論

老年性癡呆是一類以漸進性癡呆和皮質萎縮為主要特征的老年性疾病，其發病也可能是遺傳和環境共同作用的結果［4］。腦老化在器官老化中占有非常重要的地位，研究較多。腦老化患者其臨床最突出的特點之一是學習、記憶功能的明顯降低，反應遲鈍;其病理表現是神經元突觸減少，神經元纖維纏結形成［5］。中醫理論認為臟腑功能紊亂是AD 發生的前提，繼之產生的內生濁毒是重要的病理因素。臟腑功能不足，尤其是腎精的不足，是導致AD 的先決條件。內生濁毒不僅是AD 發病的關鍵病理因素，也是進一步損傷臟腑功能的繼發因素。西醫學認為Aβ 的過度沉積和tau 蛋白異常聚集形成的神經原纖維纏結是AD 形成的重要病理標志，它不僅是人體衰老的產物，也是進一步加劇AD 的關鍵因素這與中醫學所說的內生濁毒有很高的一致性。

老年性癡呆與細胞凋亡的關系近來引起廣泛關注，在培養細胞、動物模型以及老年性癡呆病人的尸解中，均發現了細胞凋亡的證據，在阿爾茨海默病過程中也有凋亡發生［2］。目前認為，神經細胞丟失與患者智能衰退的關系最為密切。近來研究發現，阿爾茨海默病患者腦內細胞丟失的機制可能與細胞凋亡有關。活性氧引起細胞凋亡是阿爾茨海默病發病的重要原因。通過D-gal 產生活性氧過荷來進行造模，旨在觀察二十五味珊瑚丸對海馬神經元由D-gal造模后產生的細胞凋亡的抑制作用，加上后續的實驗對其機制進行研究，從而為二十五味珊瑚丸防治老年性癡呆提供新的線索。

神經元特異性烯醇化酶(NSE)是一種神經系統特異性蛋白質，是糖酵解過程的催化酶，主要存在于神經元和神經內分泌細胞的胞漿中，其含量可敏感而特異性地反應神經元損傷程度。是目前唯一能特異性反映神經元損傷的生化標志物［3，6］。腦組織損傷致神經元損傷或壞死后，NSE 迅速從細胞內溢入腦脊液，通過受損的血腦屏障進入血液中，致血清NSE 濃度升高，其含量可反映神經元受損的程度，對早期直接而準確地了解腦損傷程度，具有重要的臨床意義［7］。故NSE 是神經元損傷最為敏感的生化指標，可作為腦保護作用藥物療效的重要評價指標。

D-半乳糖作為衰老模型1991年由我國學者龔國清等首次提出，隨后許多學者在大鼠和小鼠上都證實該模型表現出與人類自然衰老相類似的生化改變、免疫功能低下、基因表達調控異常、細胞生長繁殖能力下降、細胞的退行性變、大鼠記憶鞏固和再現障礙等現象，其機理是氧自由基介導的脂質過氧化效應。

D-半乳糖致大鼠衰老模型，表現為退行性病變，是一種簡便優良的衰老模型。海馬是腦內參與記憶貯存功能的重要部分，海馬中與記憶有關的神經元主要是齒狀回DG 區、海馬CA1 區和CA3 區錐體細胞。D-半乳糖衰老鼠學習記憶功能下降，齒狀回DG 區、海馬CA1 區和CA3 區的TUNEL 陽性細胞顯著增加，細胞萎縮和核固縮，大量神經元變性。

AD 是一種多因素相關的復雜性疾病.近年來，研發的一些AD 治療藥物在臨床試驗中不成功，重要原因是藥物僅針對單靶點或單致病途徑，因此目前國際上許多學者提出，應當轉換思路，應用多靶點、多途徑的治療策略來研發治療AD 的藥物。在這方面我國的中藥具有優勢。藏藥名方二十五味珊瑚丸，以芳香開竅，活血化瘀藥物為主，對腦部神經血管病變具有較好的療效，適用于藏醫理論中的“白脈病”，如神志不清、身體麻木、頭暈目眩、血壓不調、頭痛、癲癇及各種神經性疼痛。目前，二十五味珊瑚丸的各項研究工作較以往有了長足的進步，但是一直缺少現代藥理學的研究。本方中含有多味中草藥，研究表明，珍珠母具有抗腦缺血作用，可以明顯降低局灶性腦缺血大鼠腦組織中單核細胞趨化蛋白(MCP-1)的表達。MCP-1 是腦缺血損傷中的重要因子，表達顯著增加，它可以強烈趨化單核細胞，引起一系列的炎癥反應，而炎癥反應在腦缺血損傷中占重要地位。訶子常應用在藏醫學、蒙藥中，是蒙藥中應用比例最大、功用最廣泛的藥物，被稱之蒙藥之王。訶子提取物含藥血清對H2O2損傷心肌細胞具有保護作用，其機制可能與穩定細胞膜和抗氧化有關;麝香提取物對脂多糖所致神經細胞炎性損傷具有顯著的保護作用。麝香能明顯縮小水腫區移行帶，有利于三羧酸循環進行和膜結構的穩定;吳啟端等通過實驗研究發現石菖蒲具有興奮CNS，抗缺氧，清除自由基，抑制腦神經細胞凋亡作用，并有防止腦組織萎縮的作用，從而有效地延緩腦組織的衰老和改善小鼠學習記憶功能。石菖蒲對神經元的保護作用可能是防止神經元變性或延緩神經元結構的改變。因此，我們推測二十五味珊瑚丸對神經元細胞有一定的保護作用。

實驗結果顯示:與對照組相比，模型組大鼠海馬CA3 區的錐體細胞層排列層次紊亂，數量減少，細胞萎縮和核固縮，海馬齒狀回DG 區NSE 表達的細胞數較多，胞體和突起較肥大，海馬NSE 蛋白表達增多，提示D-半乳糖大鼠的海馬神經元變性、受損。與模型組相比，二十五味珊瑚丸組大鼠CA3 區的錐體細胞層排列層次整齊，數量較多，細胞萎縮和核固縮減輕，齒狀回DG 區的NSE 表達的細胞數較少，胞體和突起較小，海馬NSE 蛋白表達下降，說明二十五味珊瑚丸能抑制D-半乳糖誘導的神經元變性，從而減輕神經元的損傷。本實驗也說明藏藥在治療AD 在實驗研究方面，可以通過減低炎癥反應、抑制凋亡、增強神經生長、提高抗氧化能力等環節，改善模型動物學習記憶功能，體現了中醫多途徑、多環節、多靶點的優勢。隨著對中醫藥治療AD 機制的深入研究，探索AD 中醫病理與西醫病理之間的交叉點，發現兩者之間的內在聯系，可成為篩選有效治療AD 藥物的途徑。這些結果為拓展二十五味珊瑚丸藥效和深入洞察其藥理作用提供了實驗資料。但對于二十五味珊瑚丸的哪些有效成分，以及通過何種途徑抑制神經元變性，還有待深入研究。

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3 Du WB(杜文兵)，Huang FK(黃福開)，Luo YD(羅遠帶)，et al.Pharmacological and clinical research progress of 25 odors coral pills.World J Integr Tradit Western Med (世界中西醫結合雜志)，2013，8:537-540.

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