鼠尾草酸的抗氧化活性及抑菌活性研究

夏田娟，畢良武，2*，趙振東，2，邢雅麗，程 賢

1中國林業科學研究院林產化學工業研究所 生物質化學利用國家工程實驗室;國家林業局 林產化學工程重點開放性實驗室江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，南京 210042;2 中國林業科學研究院林業新技術研究所，北京 100091

鼠尾草酸(Carnosic acid，簡稱CA)，酚型二萜類化合物，分子式為C20H28O4，相對分子質量為332.43，是迷迭香和鼠尾草等植物中重要的天然抗氧化活性成分［1］。鼠尾草酸的外觀為無色至淡黃色粉末晶體，易溶于油脂不溶于水，具有高效、安全、耐高溫等特性［2］。作為重要的天然抗氧化劑，鼠尾草酸被廣泛地應用于油脂及含脂食品、醫藥、飼料和化妝品等方面［3-5］。此外，鼠尾草酸所具有的良好抑菌活性也得到了廣泛關注［6］。

為深入挖掘鼠尾草酸的良好的生物活性以及充分開發和利用鼠尾草酸資源提供科學依據，采用當前公認的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH 自由基清除能力、2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽ABTS 自由基清除能力、鐵還原力等抗氧化活性檢測與評價方法［7-9］，進一步對鼠尾草酸與多種常規的合成抗氧化劑的抗氧化性能進行比較;同時，通過平板二倍稀釋法［10］測試和評價迷迭香提取物、鼠尾草酸粗品、鼠尾草酸隨著鼠尾草酸純度的提高對六種不同菌種的最低抑菌濃度，探討不同純度的鼠尾草酸其抗菌種類及抗菌效果，為今后更好、更系統地開發和利用鼠尾草酸的抗氧化活性和抑菌活性提供參考。

1 材料與儀器

1.1 原料、試劑與儀器

UV9100 紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器有限公司;TG1650-WS 臺式高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司;HPX-Ⅲ系列恒溫恒濕箱，上海新昌醫療器械制造有限公司;數顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司;LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;YCD209 超聲波加濕器，北京亞都室內環保科技股份有限公司;移液器，杭州陸恒生物科技有限公司。

無水乙醇、三氯化鐵，南京化學試劑有限公司;DPPH、ABTS 阿拉丁試劑(上海)有限公司;BHQ、BHT、BHA、PG，薩恩化學技術(上海)有限公司;VE，上海源葉生物科技有限公司;三氯乙酸、過硫酸鉀，購于國藥集團化學試劑有限公司;鐵氰化鉀，上海強順化學試劑有限公司;苯扎溴銨溶液(新潔爾滅)，南昌白云藥業有限公司;氨芐青霉素鈉，上海將來實業有限公司;紅霉素，北京曙光藥業有限責任公司;水解酪蛋白瓊脂(MH)，上海博微生物技有限公司。

大腸埃希式桿菌(CMCC-441.2，Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(CMCC-26003，Staphyloccocus aureu)、表皮葡萄球菌(CMCC-26069，Staphyloccocus epidermidis)、綠膿假單胞菌(CMCC-10104，Pseudomonas aeruginosa)、產氣腸桿菌(GIM-1.234，Escherichia aerogenes)、肺炎克雷氏菌(GIM-1.279，Klebsiella pneumonia)，中國微生物菌種網–北京北納創聯生物技術研究院。

迷迭香葉子，河南省禹州市湫水迷迭香種植有限公司。

1.2 實驗方法

迷迭香提取物的制備:稱取一定量的迷迭香葉子粉，按液固比16∶1(mL/g)加入75%的乙醇，加入3%乙酸作為穩定劑(相對于乙醇)，超聲頻率28 kHz，超聲功率200 W，超聲提取時間40 min，超聲溫度35 ℃。提取液經過濾得濾液，濾液減壓蒸餾得到迷迭香提取物浸膏，在40 ℃真空干燥箱干燥后研缽內研磨，即得迷迭香提取物粉末，HPLC 檢測其中鼠尾草酸含量約為20%。

鼠尾草酸粗品的制備:稱取一定量的迷迭香提取物粉末，按液固比20∶1(mL/g)加入適量的正己烷，超聲頻率28 kHz，超聲功率140 W，超聲提取時間40 min，超聲溫度35 ℃。提取液經過濾得濾液，濾液用一定量3%的碳酸氫鈉溶液萃取，分液漏斗靜置分液，水相用30%鹽酸調節pH 至2.0。然后用正己烷再次萃取，萃取液減壓濃縮至干，在研缽中研磨即得鼠尾草酸粗品，HPLC 檢測其中鼠尾草酸含量約為75%。

鼠尾草酸的制備:取一定量的鼠尾草酸粗品，一定量200～300 目的硅膠、乙酸乙酯∶石油醚=4∶7(v/v)、洗脫劑流速為4 mL/min、負載量為0.3 g，接樣量為5 mL/管，進行硅膠柱層析分離，經薄層色譜鑒定收集鼠尾草酸含量較高的幾個級分合并、減壓濃縮至干，即得鼠尾草酸，HPLC 檢測其中鼠尾草酸含量約為97%。

1.2.1 鼠尾草酸的DPPH 自由基清除能力測定［7］

(1)用無水乙醇配置1 mmol/L 的DPPH 溶液，避光保存。將測試樣品稀釋至不同濃度;(2)將2.0 mL 測試樣品溶液及2.0 mL DPPH 溶液加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置30 min 后517 nm 處光吸收值測定其吸光度Asample，同時測定2.0 mL DPPH 溶液與2.0 mL 溶劑(無水乙醇)混合后的吸光度Acontrol，以及2.0 mL 測試樣品溶液與2.0 mL無水乙醇混合后的吸光度Ablank。按公式(1)進行DPPH 清除率的計算。以同等濃度的叔丁基對苯二酚TBHQ、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚BHT、丁基羥基茴香醚BHA、沒食子酸丙酯PG 和VE 為對照。實驗重復三次，取平均值。

1.2.2 鼠尾草酸的ABTS 自由基清除能力測定［8］

取7 mmol/L 的ABTS 溶液5.0 mL，加入140 mmol/L 的過硫酸鉀溶液88.0 μL，室溫暗處靜置14 h，得到ABTS 自由基貯備液。用乙醇對其進行稀釋至734 nm 處的光吸收值為0.7±0.02，得ABTS 工作液。分別取0.1 mL 稀釋后的不同濃度的鼠尾草酸溶液與3.9 mL ABTS 工作液混合成樣品液，室溫避光反應6 min 后測定樣品液在734 nm 處的吸光值(Asample);以0.1 mL 無水乙醇與3.9 mL ABTS 工作液混合進行空白試驗(Ablank)。ABTS 自由基清除率按公式(2)進行計算。以同等濃度的TBHQ、BHT、BHA、PG 和VE 為對照。實驗重復三次，取平均值。

1.2.3 鼠尾草酸的鐵還原力測定［9］

在1mL pH 值為6.6 的磷酸緩沖液中分別加入不同濃度的鼠尾草酸溶液200 μL 以及10 g/L 的鐵氰化鉀溶液1.0 mL，振蕩混勻后50 ℃恒溫水浴20 min。冷卻后加入體積分數10%的三氯乙酸溶液1.0 mL，4000 rpm 下離心10 min。取上層清液2.0 mL，依次加入2.0 mL 無水乙醇、1.0 mL 三氯化鐵溶液(1 g/L)，振蕩混勻后700 nm 處測定光吸收值。吸收值越大，說明還原力越強。以同等濃度的TBHQ、BHT、BHA、PG 和VE 為對照。實驗重復三次，取平均值。

1.2.4 鼠尾草酸抑菌活性的測定

采用平板二倍稀釋法，測定樣品的最低抑菌濃度［10］。實驗選取以下六種致病菌株，分別為:大腸埃希氏桿菌A，金黃色葡萄球菌B，表皮葡萄球菌C，綠膿假單胞桿菌D，產氣腸桿菌E，肺炎克雷伯氏菌F。參照物選擇新潔爾滅、氨芐青霉素鈉和紅霉素。實驗重復三次，取平均值。

1.2.4.1 菌種的活化

分別將六種致病菌株接種于固體斜面培養基上，在恒溫恒濕培養箱中于37 ℃下培養24 h 進行活化培養，傳二代。

1.2.4.2 培養皿的高溫滅菌

將培養皿用牛皮紙包好，置于干燥箱中，161℃，2 h。

1.2.4.3 瓊脂的配制與高壓蒸汽滅菌

取19 g 的水解酪蛋白瓊脂加入三角瓶中，加入500 mL 蒸餾水，80 ℃水浴加熱至瓊脂完全溶解。無菌封口膜封口，置于高壓蒸汽滅菌鍋內，121 ℃，滅菌30 min。然后放入60 ℃恒溫水浴鍋中，待用。

1.2.4.4 樣品溶液的配制

精確稱量0.0256 g 樣品，置于10 mL 的無菌容量瓶中，加入DMSO 使之溶解，定容，得到2560 μg/mL 的a，用移液槍取2.0 mL 的a 溶液與2.0 mL DMSO 混合，得到1280 μg/mL 的b 溶液，以同樣的方法，依次取2.0 mL 樣品溶液與2.0 mL DMSO 混合，以此倍比稀釋，可得到濃度分別為640、320、160、80、40、20 μg/mL 的一系列DMSO 樣品溶液。

1.2.4.5 含樣瓊脂平板的制備

將上述已配好的不同濃度的抗菌藥物分別加入不同的平板中，加入一定量的瓊脂，在平臺上充分混合均勻。

分別取上述已配備好的不同濃度的樣品溶液1.0 mL 加入已滅菌過的培養皿里，加入9.0 mL 瓊脂，立即混合均勻，待瓊脂完全凝固后即可得到濃度稀釋為原來的十分之一，從低到高依次為2、4、6、8、16、32、64、128、256 μg/mL 的含藥平板。

1.2.4.6 接種物的制備和接種

取已經活化過并接種到新鮮斜面上的菌種到已經滅菌處理過的試管中，加入無菌水適當稀釋，并與0.5 號麥氏比濁管對比，制備得到菌懸液的濃度約為108CFU/mL。將制備好的菌懸液接種于含樣瓊脂表面，置于30 ℃恒溫恒濕培養箱中培養24 h，觀察結果。

2 結果與分析

2.1 抗氧化活性測定結果

2.1.1 DPPH 自由基清除能力

抗氧化劑的存在可以使得DPPH 溶液紫色減褪，517 nm 處吸收減弱。鼠尾草酸及各對照物對DPPH 自由基的清除作用見圖1。由圖1 可知，鼠尾草酸及各對照物對DPPH 的清除率呈量效關系，隨著各物質質量濃度的增加，對DPPH 的清除率也相應增大，且鼠尾草酸在較低的濃度下就有較高的清除效率，其清除DPPH 的IC50值為2.53 μg/mL。鼠尾草酸質量濃度為5 μg/mL 時，對DPPH 的清除率可以達到90%以上。在所測濃度范圍內，鼠尾草酸及各對照物對DPPH 清除能力大小的順序為:TBHQ＞CA＞PG＞BHA＞BHT＞VE。

圖1 鼠尾草酸對DPPH 自由基的清除作用Fig.1 The scavenging activity of carnosic acid on DPPH radical

2.1.2 ABTS 自由基清除能力

鼠尾草酸及各對照物對ABTS 自由基的清除作用見圖2。由圖2 可知，在所測質量濃度范圍內，鼠尾草酸及各對照物對ABTS 自由基的清除能力隨著質量濃度的增大而增強，鼠尾草酸對ABTS 自由基的IC50為51.58 μg/mL。在質量濃度為100 μg/mL時，鼠尾草酸的ABTS 清除率為88.40%，TBHQ 為90.15%，PG 為81.23%，BHA 為70.59%，BHT 為33.48%，VE 為32.75%。同等濃度下，鼠尾草酸的清除能力均高于PG、BHT、BHA 和VE，僅低于TBHQ。在所測濃度范圍內，鼠尾草酸及各對照物對ABTS 清除能力大小的順序為:TBHQ＞CA＞PG＞BHA＞BHT＞VE。

圖2 鼠尾草酸對ABTS 自由基的清除作用Fig.2 The scavenging activity of carnosic acid on ABTS radical

2.1.3 鐵離子還原力

氧化活性與還原力之間的普遍相關性決定了可以通過測定還原力來表征抗氧化活性的強弱。鼠尾草酸及各對照物的鐵離子還原能力見圖3。由圖3可知，鼠尾草酸及各對照物的質量濃度與其還原力間呈一定的線性關系。當質量濃度為20 μg/mL時，鼠尾草酸在700 nm 處光吸收值(即還原力)為0.549，TBHQ 為0.642，PG 為0.475，BHA 為0.425，BHT 為0.330，VE 為0.327。隨著濃度的增大，鼠尾草酸及各對照物的還原力大小差異也逐漸增大，當濃度為100 μg/mL 時，鼠尾草酸的光吸收值為2.189，TBHQ 為2.230，PG 為2.034，BHA 為1.623，BHT 為1.349，VE 為1.152。同等質量濃度下，鼠尾草酸的還原力均高于PG、BHT、BHA 和VE，僅低于TBHQ。在所測質量濃度范圍內，鼠尾草酸及各對照物的鐵離子還原力大小的順序為:TBHQ＞CA＞PG＞BHA＞BHT＞VE。

圖3 鼠尾草酸的還原能力Fig.3 Reducing ability of carnosic acid

2.2 抑菌活性測定結果

實驗選取了六種代表性菌株進行抑菌活性研究，分別為大腸埃希氏菌A，金黃色葡萄球菌B，表皮葡萄球菌C，綠膿假單胞菌D，產氣腸桿菌E，肺炎克雷伯氏菌F。其中，A、B、D、E 為革蘭氏陰性菌(G+)，C、F 為革蘭氏陽性菌(G-)。所測試的三種樣品對不同菌株的抑制作用列于表1 中。

從表1 中可以看出，三種樣品對六種菌種均有一定的抑制作用。迷迭香提取物、鼠尾草酸粗品、鼠尾草酸對大腸埃希式桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的抑制效果不相上下;對綠膿假單胞菌的抑制效果最好，其最低抑菌濃度都＜2 μg/mL;對于產氣腸桿菌，迷迭香提取物和鼠尾草酸粗品表現出了同樣的抑菌效果，鼠尾草酸則對該菌種的抑制效果不明顯;對于肺炎克雷伯氏菌，可以看出迷迭香提取物、鼠尾草酸粗品、鼠尾草酸對其抑制效果越來越顯著，鼠尾草酸則表現出了最好的抑菌效果，最低抑菌濃度達到了＜2 μg/mL，可以看出，隨著鼠尾草酸含量的提高，抑菌效果也出現顯著提高，這可以從鼠尾草酸具有良好的抗炎、抗菌作用得到證明。因迷迭香提取物、鼠尾草酸粗品、鼠尾草酸中鼠尾草酸純度的差別可能導致對不同的菌種具有不同的抑制作用，也可能是由于這三種樣品中含有的迷迭香酸、鼠尾草酚等物質的影響而導致對不同的菌種有不同的抑制效果，需要進一步的研究才能給出確切的結論。

在與三種對照物的對比中發現:對于大腸埃希氏桿菌、綠膿假單胞菌，鼠尾草酸的最低抑菌濃度分別為4 和＜2 μg/mL，表現出了比新潔爾滅、氨芐青霉素鈉、紅霉素更好的抗菌性;對于金黃色葡萄球菌，鼠尾草酸的最低抑菌濃度為8 μg/mL，優于新潔爾滅，但差于氨芐青霉素鈉和紅霉素;對于表皮葡萄球菌，鼠尾草酸的最低抑菌濃度為4 μg/mL，優于新潔爾滅和氨芐青霉素鈉，差于紅霉素;對于產氣腸桿菌，鼠尾草酸表現出了和新潔爾滅同樣的抑菌效果，最低抑菌濃度均為128 μg/mL，優于氨芐青霉素鈉的，差于紅霉素;對于肺炎克雷伯氏菌，鼠尾草酸表現出了和紅霉素同樣的抑菌效果，其最低抑菌濃度均為＜2 μg/mL，優于新潔爾滅和氨芐青霉素鈉。從表1 中可以看出，鼠尾草酸具有一定的廣譜抗菌性，對于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均表現出了良好的抑菌效果，但比較之后發現，鼠尾草酸對于革蘭氏陰性菌具有相對較廣泛的抑制作用，但對于革蘭氏陰性菌中的肺炎克雷伯氏菌，鼠尾草酸具有比三種對照物更好的抑制效果，這說明鼠尾草酸同樣具有很好的抗炎作用。

表1 不同濃度鼠尾草酸的最小抑菌濃度(μg/mL)Table 1 MIC of carnosic acid under different concentrations

3 討論

經DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、鐵還原力等3 種體外抗氧化評價指標評定，發現鼠尾草酸具有比合成抗氧化劑PG、BHT、BHA、VE更好、僅次于TBHQ 的抗氧化性能，可在較低的濃度水平發揮較強的抗氧化能力，其清除DPPH 自由基的IC50值為2.53 μg/mL，清除ABTS 自由基的IC50值為51.58 μg/mL。相對于合成抗氧化劑，鼠尾草酸具有低毒性，因而可作為天然食品抗氧化劑加以開發利用。

經平板二倍稀釋法發現:對于大腸埃希氏桿菌、綠膿假單胞菌，鼠尾草酸的最低抑菌濃度分別為4和＜2 μg/mL，表現出了比新潔爾、氨芐青霉素鈉、紅霉素更好的抗菌性;對于金黃色葡萄球菌，鼠尾草酸的最低抑菌濃度為8 μg/mL，優于新潔爾滅，但差于氨芐青霉素鈉和紅霉素;對于表皮葡萄球菌，鼠尾草酸的最低抑菌濃度4 μg/mL，優于新潔爾滅和氨芐青霉素鈉，差于紅霉素;對于產氣腸桿菌，鼠尾草酸表現出了與新潔爾滅相同的抑菌效果，最低抑菌濃度均為128 μg/mL，優于氨芐青霉素鈉的，差于紅霉素;對于肺炎克雷伯氏菌，鼠尾草酸表現出了和紅霉素同樣的抑菌效果，其最低抑菌濃度均為＜2 μg/mL，優于新潔爾滅和氨芐青霉素鈉。隨著鼠尾草酸含量的提高，抑菌效果也出現顯著提高，說明鼠尾草酸具有良好的抗炎、抗菌作用。

對鼠尾草酸的生物活性研究最多的就是其抗氧化性，且其多用于油脂及含脂食品的保鮮、貯存，食品的添加劑和化妝品等方面，Du 等［11］僅指出鼠尾草酸的抗氧化能力指數是BHT、VE的3 倍，但低于BHA，Zhang 等［12］則通過定期測定過氧化值、硫代巴比妥酸值、游離脂肪酸含量及茴香胺值等各項參數，來比較鼠尾草酸與合成抗氧化劑對葵花籽油脂質的抗氧化作用，實驗發現:隨著鼠尾草酸濃度的增加，其對葵花籽油脂質的抗氧化作用顯著增強，并且顯示出了比合成抗氧化劑BHT 和BHA 更強的抗氧化活性。本研究在以往文獻資料的基礎上補充了鼠尾草酸和TBHQ、PG 的抗氧化性的強弱，對鼠尾草酸和常見的合成抗氧化劑TBHQ、BHT、BHA、PG 和VE均進行了比較，且得出了這六種物質抗氧化性強弱的順序:TBHQ＞CA＞PG＞BHA＞BHT＞VE。大多數人類的疾病都是由氧化應激造成的，如糖尿病及慢性并發癥、肺纖維化、高血壓、感冒、動脈粥樣硬化和相應的心血管疾病、癌癥和帕金森病等。鑒于鼠尾草酸良好的抗氧化活性，其有可能在抗衰老方面發揮作用，已經有報道鼠尾草酸具有抗微血管分支生成的功效［13］，鼠尾草酸在未來有可能成為治療心血管疾病的良藥。

關于鼠尾草酸的抑菌活性，國內外也有相關類文獻研究了鼠尾草酸對不同菌株的抑制效果，但大多只針對于某一特定菌種［6，14］，未能全面的探究鼠尾草酸對不同菌株的抑制效果。大多數革蘭氏陽性菌的致病物質主要為外霉素，而大多數革蘭氏陰性菌的致病物質主要為內霉素，為此，實驗選擇革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌來研究鼠尾草酸對二者的抑制效果，能清晰地辨別出鼠尾草酸在疾病治療方面適合針對何種霉素引起的細菌感染等疾病，為進一步開發利用鼠尾草酸在醫學中的應用奠定理論基礎。因此，本研究結果對鼠尾草酸的抑菌活性作了更進一步的補充。實驗發現鼠尾草酸對于革蘭氏陰性菌具有相對較廣泛的抑制作用，其抑菌機理還有待進一步研究發現。

鑒于鼠尾草酸良好的抑菌效果，因此有待加強對其抑菌活性及機理的進一步研究探索，使其盡早應用于人類疾病的治療。鑒于鼠尾草酸具有良好的抗氧化和抑菌作用，可以進一步研究開發其成為新型的天然防腐保鮮劑的原料。

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