沼液中化學成分的研究

吳慧斌，劉丁才，許劍鋒

上海海洋大學食品學院，上海 201306

沼液是人畜糞便和各種農作物秸稈等有機物經沼氣池密封厭氧發酵產生沼氣后的液體殘留物［1］，是沼氣工程產生的兩大副產物之一，主要被用作葉面肥、飼料添加劑、浸泡種子等。目前研究表明，沼液是一種速效水肥，含有多種農作物所需的營養元素［2，3］，它不僅含有作物生長所必需的氮、磷、鉀、微量元素、氨基酸等多種營養物質，而且含有植物生長激素、B 族維生素、抗生素等活性、抗性物質［4］。研究發現，通過對生長作物噴灑沼液有促進作物生長和預防或抑制病蟲害的作用，而且對20 多種病蟲害的防治效果達到或超過了現在使用的農藥效果［5］，但目前研究僅限于沼液的理化性質，礦物質含量、重金屬含量以及氨基酸和B 族維生素含量的測定，對其抑菌機理和化學成分的詳細研究并沒有報道。而現在沼氣應用已在全國范圍內大范圍推廣，沼液的量急劇增加，所以對沼液成分的研究有利于廢棄物的綜合利用，不僅可以減少農藥和一些化學藥品的使用，降低農業成本，同時也可以減少對環境的污染，有較高的社會效益。

本研究針對以雞糞為原料的沼液成分進行了分析鑒定，劉丁才等在前期的工作中已經從沼渣中分離到6 個化合物，β-谷甾醇、22β-羥基-β-白檀桐、29-羥基-12-土當歸烯-3，22-二酮、17β-雌二醇、S(-)-雌馬酚［6］。在之前研究的基礎上從沼液中進一步分離出4 個化合物，經鑒定，一個為新化合物，24-降齊墩果烷-4，12-二烯-3，22-二酮(1)，3 個為已知化合物，8-羥基-3，4-二氫喹啉-2 酮(2)、(E)-3-(2-羥基苯)丙烯酰胺(3)、苯乙酸(4)。這些化合物都是從雞糞沼液中首次分離出來。其中，研究發現苯乙酸在體內具有抑制腫瘤生長，誘導細胞凋亡的作用，但是有劑量依賴性［7］。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE Ⅱ600 型核磁共振儀，TMS 為內標(Bruker);Bruker ALPHA 紅外光譜儀;Waters Q-TOF 高分辨電離噴霧質譜;凝膠Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech;柱層析硅膠(200～300 目)和硅膠薄層色譜預制板(GF254)購自青島海洋化工有限公司;制備HPLC 色譜柱填料(Sino Chrom ODS-BP 10 μm，20 mm ×250 mm;色譜處理系統:EC2000 GPC 系統)購自大連依利特分析儀器有限公司;液相色譜級甲醇、乙腈購自Sigma 公司;水為娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純(AR)，上海國藥集團化學試劑公司;沼液取自于上海市浦東新區六灶鎮文彬養雞場沼氣池，經同濟大學現代農業科學與工程研究院朱洪光教授鑒定為以雞糞為原料產生的沼液，標本現存于上海海洋大學食品學院海洋與生物制藥研究室。

2 提取與分離

雞場沼液在室溫下50 ℃減壓濃縮去掉80%水分得到沼液濃縮液，將沼液濃縮液與萃取溶劑按1∶2 進行萃取。先用石油醚進行萃取，合并濃縮后得石油醚萃取物41 g;其次用乙酸乙酯進行萃取，合并濃縮后得到乙酸乙酯萃取物84 g;再次用正丁醇進行萃取，收集、濃縮得到正丁醇萃取物57 g;由于余下水相所溶物質一般都是極性很大的糖類、蛋白等，故舍棄。

沼液石油醚和乙酸乙酯萃取部分，經薄層色譜(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)展開，并用10%濃硫酸乙醇溶液染色烘干后發現有相同的顯色點，因此合并兩個部位。向萃取物浸膏中加入等量的粗硅膠，攪拌均勻并烘干上樣，經200～300 目硅膠柱層析，依次以石油醚:乙酸乙酯(PE/EA)(100∶0→30∶1→25∶1→20∶1→15∶1→8∶1→3∶1→1∶1)梯度洗脫，洗脫液根據TLC 檢測結果合并、濃縮，得到四部分(F1～F4)。F3 經200～300 目硅膠柱層析，硅膠H 柱層析，葡聚糖LH-20 柱層析，再經半制備HPLC 純化，以88%甲醇/水溶劑等度洗脫，流速10 mL/min，收集時間tR=14.32 min 出峰的組分，得化合物1。

將沼液正丁醇部分經300～400 目硅膠柱層析，依次以氯仿/甲醇溶液(30∶1→25∶1→20∶1→15∶1→10∶1→5∶1→1∶1)梯度洗脫，洗脫液根據薄層色譜(TLC)檢測結果合并、濃縮，得五個部分(N1～N5)。第三部分先用少量甲醇萃取，減壓濃縮，再經凝膠LH-20 層析以100%甲醇溶液進行反復等度洗脫，得到化合物2;第四部分直接用少量甲醇萃取，然后減壓濃縮，再經凝膠LH-20 層析以100%甲醇溶液進行反復等度洗脫，得到化合物3 和4。

3 結構鑒定

圖1 化合物1 的主要二維相關信號Fig.1 Key COSY (—)and HMBC )correlations of compound 1

表1 化合物1 的核磁共振數據Table 1 1D-and 2D NMR data of 1(CDCl3)

化合物2 白色無定型粉末，易溶于甲醇;IR(KBr)vmax:3224，1644，1587，1492，1440，1271，1197，795，739 cm-1;1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:6.80 (1H，t，J=7.8 Hz，H-6)，6.68 (1H，d，J=8.4 Hz，H-7)，6.65 (1H，dd，J=7.5，1.1 Hz，H-5)，4.48(1H，s，8-OH)，2.91 (2H，t，J=7.5 Hz，H-4)，2.55(2H，t，J=7.6，H-3);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:173.3 (s，C-2)，145.3 (s，C-8)，126.3 (s，C-9)，126.0 (s，C-9)，124.2 (d，C-6)，119.6 (d，C-5)，114.4 (d，C-3)，31.6 (t，C-3)，26.2 (t，C-4)。化合物2 的13C NMR 數據與已知結構8-羥基-3，4-二氫喹啉-2 酮的文獻［9］數據相比，二者一致，從而確定了化合物2 的結構。

化合物3 無色片狀晶體(MeOH);IR (KBr)vmax:3445，654，1600，1556，1427，1351，1028，757 cm-1;1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:7.95 (1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，7.65 (1H，dd，J=7.8，0.8 Hz，H-6')，7.53 (1H，td，J=7.6，1.3 Hz，H-4')，7.35(1H，d，J=8.3 Hz，H-3')，7.24 (1H，td，J=7.5，0.9 Hz，H-5')，6.61 (1H，d，J=9.4 Hz，H-2)，4.86(1H，OH-1');13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:165.4(s，C-1)，142.7 (d，C-3)，139.8 (s，C-2')，131.9(d，C-4')，129.1 (d，C-6)，123.9 (d，C-5)，121.6(d，C-2)，121.4 (s，C-1')，116.8 (d，C-3')。推出來的結構與已知結構o-coumaric acid amide［10］的結構一致，從而確定了化合物3 就是(E)-3-(2-羥基苯)丙烯酰胺。

化合物4 無色不定型結晶(MeOH)，易溶于甲醇和乙醇，有刺激揮發氣味。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:7.26-7.31 (4H，m，H-2'，H-3'，H-5'，H-6')，7.21～7.24 (1H，m，H-4')，4.92 (1H，brs，OH)，3.58 (2H，s，H-2);13C NMR (CD3OD，150 MHz)δ:175.5 (s，C-1)，136.0 (s，C-1')，130.3 (d，C-2'，6')，129.4 (d，C-3'，C-5')，127.8 (d，C-4')，41.9(t，C-2)。化合物4 的13C NMR 與已知結構苯乙酸的文獻［11］數據相比，二者完全一致，從而確定了化合物4 的結構。

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