枸杞子提取物對小鼠腸道菌群失衡的調整作用

劉云婷，徐 巍，辛 毅，李新莉

大連醫科大學生物技術系，大連 116044

人體腸道中存在著大量微生物，其中超過99%都是細菌，人體的健康程度與腸道菌群結構息息相關。在長期的進化過程中，腸道菌群經過個體的適應和自然選擇，菌群中不同種類之間，菌群與宿主之間，菌群、宿主與環境之間，始終處于一種動態平衡狀態中，形成了一個互相依存，相互制約的系統。因此，人體在正常情況下，菌群結構相對穩定，對宿主表現為不致病，而一旦打破了這種平衡，就有可能產生腹瀉、陰道感染、人體免疫力降低、血清膽固醇增高甚至提高了癌癥和腫瘤的發生率［1］。在食品中添加益生元成為解決這一問題的重要途徑［2］。枸杞子(Fructus Lycii)是茄科植物枸杞的干燥成熟果實，素有“紅寶”之稱，含有枸杞多糖、甜菜堿、核黃素、甾醇、蕓香苷和枸杞葉蛋白等有效成分以及多種氨基酸和微量元素［3］，具有滋補肝腎，益精明目的功效，是歷代醫藥學家推崇的上等滋補珍品。近年來用現代醫藥學的手段對枸杞子的研究日漸活躍，證明了枸杞子對人體具有多種有益作用和療效［4］。本實驗考察了不同濃度枸杞子提取物對抗生素相關性菌群失衡小鼠的調整作用，檢測小鼠糞便主要優勢菌數量的變化，以明確枸杞子是否可以成為新一代的益生元，為其進一步開發利用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UVS-1 渦旋振蕩器(北京優晟聯合科技有限公司);HC-3018R 高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學有限公司);BCM 潔凈操作臺(蘇州真田潔凈設備有限公司);HPX-9052MBE 電熱恒溫培養箱(常州諾基儀器有限公司);高壓蒸汽滅菌鍋(創博環球生物科技有限公司);恒溫水浴鍋(金壇市華特實驗儀器有限公司)。

1.2 試藥

枸杞子(銀川寧杞紅土特產有限公司);頭孢拉定膠囊(長春迪瑞制藥有限公司，批號:H20063308，規格:每粒0.25 g);LBS 培養基(乳酸桿菌選擇培養基)、BS 培養基(雙歧桿菌選擇培養基)、EMB 培養基(腸桿菌選擇培養基)、EC 培養基(腸球菌選擇培養基)、胰蛋白胨(青島海博生物技術有限公司);酵母提取物(OXIOD，進口分裝);瓊脂粉(北京奧博星生物技術有限責任公司);氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純(上海國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 動物

SPF 級BALB/c 小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2008-0002。

2 實驗方法

2.1 枸杞子提取物的制備

稱取干燥枸杞子100 g，加水1 L 浸泡1 h，煎煮1 h，過濾，濾渣加同量水再煎一次，合并濾液蒸發濃縮至250 mL，生藥濃度為0.4 g/mL。

2.2 藥品配制

頭孢拉定用蒸餾水配制成10 mg/mL。以生藥濃度為0.4 g/mL 的枸杞子溶液為高濃度提取物。取10 mL 枸杞子高濃度提取物加入10 mL 蒸餾水，配置生藥濃度為0.2 g/mL 的枸杞子低濃度提取物。

2.3 分組與處理

動物給藥劑量參照公式dB=dA× (KB/KA)。其中，dA(dB)為A(B)種動物每千克體重給藥劑量;KA(KB)為A(B)種動物的折算系數。

40 只小鼠隨機分為5 組:正常對照組(N)、枸杞子提取物高濃度組(H)、低濃度組(L)、模型組(C)和自然恢復組(R)，每組8 只。除正常對照組外，其他組均灌服10 mg/mL 頭孢拉定溶液7 d，0.2 mL/d 建立腸道菌群失調模型。第8 d 分別用0.4 g/mL 枸杞子提取物、0.2 g/mL 枸杞子提取物、10 mg/mL 頭孢拉定溶液、蒸餾水以0.2 mL/d 持續灌胃7 d。分別在實驗的0、7、14 d 收取每只小鼠糞便，于-80 ℃保存備用。

2.4 腸道菌群檢測

2.4.1 標本處理

取小鼠糞便0.2 g 于無菌試管(編號1)，加入1.8 mL 無菌PBS 溶液(pH 7.4)，混勻至糞便均質化，此為10 倍稀釋。取7 個無菌試管(編號為2～8)，各加入4.5 mL 無菌PBS 溶液，然后從管1 中取出0.5 mL 糞便均質化溶液，放入管2，充分混勻，即為100 倍稀釋，依次進行倍比稀釋，至108倍稀釋備用。

2.4.2 標本滴種

嚴格按說明書要求，配制LBS、BS、EMB、EC 培養基，115 ℃高壓滅菌15 min，趁熱灌注平板，冷卻后，從高稀釋度開始(見2.4.1)，每次吸取20 μL 菌液滴種于各平皿上，滴種結束后，用涂布棒將液體涂勻。每個稀釋倍數重復3 次。EMB 和EC 培養基倒置，37 ℃培養24 h 后觀察結果;BS 培養基用厭氧罐法培養24 h 后觀察結果;LBS 培養基用厭氧罐法培養46 h 后觀察結果。

2.4.3 活菌計數

對菌落個數為10～100 的平板進行計數［5］，結果以lg cfu/g 的形式表示(見表1)。

2.5 數據分析

3 實驗結果

如表1 所示。灌服頭孢拉定后腸道各細菌與正常對照組相比均有顯著性變化(a)，提示建模成功。使用不同濃度的枸杞子提取物對腸道菌群失調小鼠進行干預，結果顯示枸杞子提取物(H 和L)能夠促進菌群失調小鼠腸道內腸桿菌的生長(b);針對乳酸桿菌和雙歧桿菌的促生長作用更加顯著(c)，枸杞子提取物的作用均明顯優于自然恢復組(d)，且低濃度對二細菌的增殖作用高于高濃度;而對腸球菌的促生效果不明顯。由上可知，枸杞子提取對乳酸桿菌和雙歧桿菌生長促進作用明顯。

表1 各組糞便標本菌群檢測結果(，lg cfu/g)Table 1 Detection of bacteria in stool samples(，lg cfu/g)

表1 各組糞便標本菌群檢測結果(，lg cfu/g)Table 1 Detection of bacteria in stool samples(，lg cfu/g)

注:a:與正常對照組相比，＊＊P＜0.01;b:與模型組相比，* P＜0.05;c:與模型組相比，＊＊P＜0.01;d:與自然恢復組相比，＊＊P＜0.01。Note:a:Compare with control，＊＊P＜0.01;b:Compare with Model group，* P＜0.05;c:Compare with Model group，＊＊P＜0.01;d:Compare with spontaneous recovery group，＊＊P＜0.01.

4 討論

抗生素是臨床治療感染性疾病的主要藥物，但長期使用會導致腸道微生態失調，造成臨床伴發性腹瀉，引起二重感染癥狀，給治療帶來困難［6］。益生元在人體內不消化或難消化，通過促進腸道內雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌的增殖而起到改善腸道菌群環境的作用［7］，對宿主的健康具有促進作用。大量文獻表明［8，9］，中藥作為益生元能夠促進腸道正常有益菌群的生長，維護機體微生態平衡。

腸道菌群可分為深層的緊貼黏膜表面的膜菌群，主要由雙歧桿菌和乳酸桿菌等共生厭氧菌組成;中層為糞桿菌、消化鏈球菌等厭氧菌;表層的細菌可游動，稱腔菌群，主要是腸桿菌、腸球菌等需氧菌［10］。研究表明若能增加腸道益生菌的比例，抑制有害菌的繁殖，就可以減少腸道腐敗、清潔腸道、促進健康、延緩衰老［11］。腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌這些優勢菌群數量的變化可以作為腸道菌群失調及失調程度的判斷標準。本研究選擇臨床常用抗生素— —頭孢拉定建立腸道菌群失調模型［6］，使用不同濃度枸杞子提取物對腸道菌群失調小鼠進行干預，通過測定小鼠糞便中上述4 種細菌數量的變化，研究枸杞子對腸道菌群失衡的調整作用。實驗結果表明，枸杞子提取物對腸道菌群失調小鼠腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌的生長具有明顯的恢復作用，且作用效果要明顯優于自然恢復組，具有顯著的益生元特性。

綜上，枸杞子提取物能夠促進乳酸桿菌和雙歧桿菌等腸道益生菌的生長，為微生態制劑的開發及中藥合理使用提供了理論依據。這種中藥微生態制劑可以與抗生素合用，減弱藥物對益生菌的抑制和殺死作用，維持腸道菌群平衡。中藥以其獨特性能如天然性、整體調節、扶正祛邪、雙向調節等作用，將有可能在一定程度上解決抗生素帶來的副作用，并在治病防病、調節機體免疫機能、平衡腸道微生態平衡等方面發揮一定的作用。

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