芒果苷對慢性支氣管炎大鼠CD4+T淋巴細胞的影響

衛智權，閻 莉*，鄧家剛*，鄧 靜

1廣西中藥藥效研究重點實驗室廣西中醫藥大學，南寧530001;2哈佛大學醫學院Dana-Farber癌癥研究所，馬薩諸塞州02115

芒果葉為漆樹科植物芒果Mangifera indica L．的葉，芒果苷(mangiferin)是芒果葉中的主要活性成分，是一種天然多酚類化合物，分子式C19H18O11，分子量422，化學結構見圖1。

芒果葉在廣西民間用于治療咳嗽、咳痰已有多年歷史，成藥芒果苷片對于支氣管炎的咳嗽、咳痰、喘息、發熱等癥狀具有顯著療效且安全性良好［1］。芒果苷對多種急慢性炎癥具有較好抗炎作用，其作用機制與其明顯抑制單核-巨噬細胞的活化密切相關［2，3］。CD4+T 淋巴細胞對于慢性支氣管炎的病理進程具有重要影響，活化的CD4+T淋巴細胞產生IL-2、IL-4等淋巴因子并進而活化B細胞、NK細胞、單核-巨噬細胞等重要的炎癥細胞，是參與支氣管及其周圍組織慢性炎癥的主要的炎癥細胞之一。迄今尚無芒果苷影響慢性支氣管炎中的CD4+T淋巴細胞的研究報道。香煙煙熏能夠建立類似于人慢性支氣管炎的動物模型，本研究擬以香煙煙熏誘導慢性支氣管炎大鼠為研究對象，觀察芒果苷對慢性支氣管炎大鼠CD4+T淋巴細胞的影響。

圖1 芒果苷的化學結構Fig.1 Chemical structure ofmangiferin

1 材料與儀器

1．1 實驗動物

SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，6周齡，體重160～180 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2011-0003］。

1．2 藥品及試劑

芒果苷由廣西中醫藥大學中藥藥效研究重點實驗室惠贈，經高效液相色譜法檢測純度為97．5%，色譜圖見圖2。香煙(廣西卷煙總廠，焦油含量12 mg/支)。IL-2與IL-4 ELISA Kit(武漢華美公司)。Anti-rat CD3-PE抗體、Anti-rat CD4-APC抗體(美國Life technologies公司)，10×RBC Lysis Buffer(Multi-species)紅細胞裂解液(美國eBioscience公司)，RNeasy Plus Mini Kit(德國 Qiagen公司)，RNAstore樣本保存液、RNAsafe RNase抑制劑、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix(Probe)預混試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］。PCR引物、TaqMan熒光探針、質粒DNA標準品由美國Invitrogen公司設計、合成。

圖2 芒果苷標準品(A)與樣品(B)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mangiferin standard(A)and mangiferin sample(B)

1．3 儀器設備

美國Thermo Fisher Scientific公司Multiskan Speetrum1500酶標儀，德國Qiagen公司QIAcube核酸純化儀，美國ABI公司7500型實時熒光PCR儀，德國Eppendorf公司5430R高速冷凍離心機，美國Becton Dickinson公司LSR Fortessa多色分析流式細胞儀與FACSAria高速流式細胞分選儀。

2 實驗方法

2．1 動物分組、給藥與標本采集

大鼠40只隨機均分為4組:正常(Control)組、模型(Model)組及芒果苷高、低劑量(MFH、MFL)組。除正常組外，在0．25立方米玻璃倉內每次用10支香煙煙熏各組大鼠，每天2次，上下午各1 h，連續6周。煙熏6周后開始灌胃給藥，正常組、模型組給生理鹽水，根據參考文獻報道的藥物劑量設置其余各組大鼠給藥劑量［4］:芒果苷高、低劑量組分別為芒果苷200、100 mg/(kg·d)，給藥時間4周，每天給藥后照常煙熏。

實驗第10周末，各組大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，下腔靜脈穿刺取血，用于分選CD4+T淋巴細胞及CD4+T淋巴細胞比例檢測;取左肺組織用于HE染色觀察支氣管炎癥病理形態變化。

2．2 外周血CD4+淋巴細胞比例檢測

取EDTA-K2抗凝全血 100μL，加入 Anti-rat CD3-PE抗體、Anti-rat CD4-APC抗體各5μL，混勻，置4℃避光反應30 min。加入紅細胞裂解液溶解紅細胞，反應10 min后，1000 rpm離心5 min，棄上清，加PBS洗滌2次去除細胞碎片和未結合的抗體。緩慢加入1%多聚甲醛固定液0．5 mL，4℃ 避光固定30 min，過400目細胞篩，立即上機檢測。

2．3 CD4+T淋巴細胞分選

取適量EDTA-K2抗凝全血，加入Anti-rat CD3-PE抗體、Anti-rat CD4-APC抗體，混勻，置4℃ 避光反應30 min，加入紅細胞裂解液溶解紅細胞，反應10 min后，1000 rpm離心5 min棄上清，加PBS洗滌2次去除細胞碎片和未結合的抗體，少量PBS重懸，立即上機進行細胞分選，以CD3-PE+并CD4-APC+設門圈選CD4+T淋巴細胞。分選所得細胞懸液調整細胞濃度至5×106/mL，置于-70℃保存備用。

2．4 ELISA檢測CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4蛋白表達水平

取CD4+T淋巴細胞懸液標準樣品2 mL，4℃離心(10000 rpm，1 min)，吸去上清，加入4℃預冷的細胞裂解勻漿緩沖液(pH 6．8的1．0 mmol/L Tris-HCl 20 mL，10%SDS 120 mL，β-巰基乙醇 4 mL，雙蒸水56 mL，混勻即得)，超聲冰浴勻漿破碎細胞，然后4℃離心(12000 rpm，15 min)，取上清液作為待測樣品。采用IL-2、IL-4的ELISA Kit，嚴格按照試劑盒說明書操作，以Curve Expert1．3曲線擬合軟件計算標準曲線的回歸方程，計算樣品中IL-2、IL-4的含量。

2．5 Real-time RT-PCR檢測CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因表達水平

取CD4+T淋巴細胞懸液標準樣品2 mL，以RNeasy PlusMini Kit總RNA提取試劑盒與QIAcube核酸純化儀提取總RNA。在RNA溶液中加入1/20體積的 RNAsafe，60℃處理20 min以使污染的RAase失活，冷卻至室溫后置于-70℃ 保存。提取的總RNA以Quant cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄獲得cDNA，于-70℃保存供下游PCR用。

目的基因IL-2與IL-4引物序列、TaqMan熒光探針序列見表1。每個PCR反應體系內容如下:2．5×Real Master Mix 20 μL，20 ×Probe Enhancer solution 2．5 μL，上、下游引物各 2 μL，cDNA 或質粒DNA標準品4μL，TaqMan熒光探針2μL，ddH2O加至50μL。PCR反應條件:95℃預變性2 min，95℃變性20 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，40個循環。

表1 引物序列和探針序列Table 1 Primer and probe sequence used in real-time RT-PCR

2．6 HE染色細支氣管炎癥病理形態觀察

各組大鼠左肺組織標本行常規石蠟包埋、切片、脫水，HE染色，光鏡下觀察細支氣管炎癥病理改變。

2．7 統計學處理

所有計量資料均以均數±標準差(ˉx±s)表示，以SPSS 13．0統計軟件進行多個樣本間均數比較。方差齊性數據采用單因素方差分析LSD檢驗，方差不齊數據采用 Kruskal Wallis秩和檢驗。以P＜0．05為差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3．1 芒果苷對外周血CD4+T淋巴細胞比例的影響

圖3 各組大鼠CD4+T淋巴細胞分析流式散點圖Fig.3 CD4+T lymphocyte analysis flow cytometry scatter plot of rats in each group

與正常組比較，模型組大鼠外周血CD4+T淋巴細胞比例明顯升高(P＜0．01)。與模型組比較，200 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)芒果苷均可抑制煙熏引起的CD4+T淋巴細胞比例升高(P＜0．01，P＜0．05)。結果見圖3、圖4。

3．2 芒果苷對CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因與蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因表達水平及蛋白表達水平顯著上調(P ＜0．01)。與模型組比較，200 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)芒果苷可抑制煙熏引起的CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4的基因與蛋白表達水平上調(P＜0．01，P ＜0．05)。結果見圖5。

圖4 各組大鼠CD4+T淋巴細胞比例Fig.4 CD4+T lymphocyte percentage of rats in each group

圖5 各組大鼠CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因和蛋白表達水平Fig.5 IL-2 and IL-4 expressions of CD4+T lymphocyte of rats in each group

3．3 HE染色支氣管炎癥病理形態觀察

正常組細支氣管的管壁結構完整，無明顯淋巴細胞浸潤。模型組細支氣管壁可見多量淋巴細胞浸潤甚至淋巴濾泡形成，管壁結構有局灶性腫脹、增厚、斷裂。200 mg/(kg·d)芒果苷組細支氣管結構大致完整，少量淋巴細胞浸潤。100 mg/(kg·d)芒果苷組細支氣管結構也存在局灶性腫脹、增厚、斷裂，中度淋巴細胞浸潤。結果見圖6。

圖6 HE染色支氣管炎癥病理組織鏡檢(×400)Fig.6 Rat histologic section of chronic bronchitis in each group(HE staining，×400)

4 討論

目前制備慢性支氣管炎模型的方法有二氧化硫吸入法、香煙煙薰法、脂多糖氣管內注入法等，其中二氧化硫吸入法、脂多糖氣管內注入法存在較多并發癥，與人類慢性支氣管炎在病因學、病理學與病理生理學方面均存在較大差距，且無法直接反映吸煙與慢性支氣管炎的關系，故近年已較少用于制備慢性支氣管炎動物模型，因而本實驗采用了已被廣泛應用的香煙煙薰法制備慢性支氣管炎動物模型。對照組大鼠在接受10周的香煙煙熏之后，其肺組織的HE染色病理觀察表現出了較為明顯的慢性支氣管炎的特征性變化:多量淋巴細胞浸潤甚至淋巴濾泡形成，管壁結構有局灶性腫脹、增厚、斷裂。因而可以認為香煙煙熏制備慢性支氣管炎大鼠模型是成功的。

世界衛生組織和世界銀行的資料顯示，因慢性支氣管炎導致的慢性阻塞性肺病的死亡率居所有死因的第4位，且有逐年增加的趨勢［5］。慢性支氣管炎的基本病理基礎是氣道炎癥，涉及IL-2、IL-4等多種炎癥細胞因子，其介導的細支氣管炎癥在慢性支氣管炎的發病中發揮了重要的作用。IL-2、IL-4是主要由活化的CD4+T淋巴細胞產生的促炎細胞因子，可活化更多的CD4+T淋巴細胞，促進B細胞增殖、分化，增強NK細胞殺傷活性，激活單核-巨噬細胞［6］。此外，IL-2、IL-4可協同IL-3刺激肥大細胞增殖，誘導IgG、IgE大量產生，從而介導氣道高反應性的病理過程，與喘息性慢性支氣管炎密切相關［7］。因此，CD4+T淋巴細胞產生IL-2、IL-4的多寡往往與慢性支氣管炎的CD4+T淋巴細胞活化程度呈同向性變化，成為考察慢性支氣管炎的T淋巴細胞活化程度的有效指標。本研究中的模型組組大鼠在接受長達10周的香煙煙熏之后，其CD4+T淋巴細胞的IL-2、IL-4基因與蛋白表達水平均持續于較高水平，表明其CD4+T淋巴細胞活化也較為劇烈。

CD4+T淋巴細胞是人體免疫系統的重要組成部分，不僅在慢性支氣管炎的急性發作期，在慢性遷延期浸潤支氣管粘膜與粘膜下組織的CD4+T淋巴細胞數量也是增加的［8］。慢性遷延期的患者肺內仍存在一定程度的炎癥活動，外周血CD4+T淋巴細胞增加，機體仍然持續處于不同程度的炎癥損傷之下［9，10］。這些T淋巴細胞亞群的病理性變化也是慢性支氣管炎能夠持續存在并反復發作的重要原因之一。本研究中的模型組大鼠的CD4+T淋巴細胞比例明顯升高，顯然與其支氣管炎癥持續活躍密切相關，其HE染色細支氣管炎癥病理形態觀察可見多量淋巴細胞浸潤的結果也支持此推論。

在本研究中，接受芒果苷干預的大鼠其HE染色組織病理形態觀察均可見到較為明顯的細支氣管炎癥減輕，其抗炎效果呈明顯的劑量依賴性，較高的芒果苷劑量可帶來更好的抗炎效果。同時觀察到的芒果苷干預抑制CD4+T淋巴細胞活化，包括CD4+T淋巴細胞比例以及CD4+T淋巴細胞IL-2、IL-4基因與蛋白表達水平顯著下調，也呈現不同程度的劑量依賴性。上述結果提示，芒果苷能夠以劑量依賴性的方式抑制CD4+T淋巴細胞活化，顯著減輕香煙煙熏誘導的大鼠慢性支氣管炎的炎癥細胞浸潤、支氣管及其周圍組織的損傷，具有較為良好的抗炎及組織保護作用，這些新的實驗證據顯著增加了芒果苷在慢性支氣管炎治療新藥研發領域的潛在價值。

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