補(bǔ)腎固筋方對SD 大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎IL-1、iNOS 分泌的抑制作用

張 沖 ，渠玲玲，王恒樹，張春利，李雙成，黃 蕓*，吳中秋

1河北省中醫(yī)院骨三科，石家莊 050000;2 河北醫(yī)科大學(xué);3河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊 050011;4 河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050017

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)軟骨下骨萎縮象牙樣硬化，關(guān)節(jié)囊纖維變性為病理特征的慢性退行性病變。病變關(guān)節(jié)腫脹輕度壓痛，伴滑膜炎時可見關(guān)節(jié)內(nèi)積液，嚴(yán)重者有不同程度的肌萎縮或關(guān)節(jié)畸形。《素問·痹論》:風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹［1］。臨床多用非甾體類藥物或脛骨高位截骨、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，患者難以接受［2］。近年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)熟地、千年健等中藥治療KOA 療效確切［3］。本實驗擬闡明補(bǔ)腎固筋方對IL-1、iNOS 的調(diào)節(jié)與KOA 的作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SD 大鼠44 只，15 月齡，健康，雄性，飼養(yǎng)到28月齡體重350～370 g，根據(jù)人鼠齡換算此月齡大鼠與中老年人相近。河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［動物質(zhì)量合格證號:SYXK(滬)2013-0231］。

1.2 藥物

補(bǔ)腎固筋方組:熟地15 g、補(bǔ)骨脂12 g、枸杞子10 g、巴戟天10 g、牛膝12 g、丹參10 g、木瓜8 g、雞血藤10 g，根據(jù)進(jìn)食情況、精神，喜暖惡寒，活動等中醫(yī)辨證加減治療，風(fēng)寒濕痹加防風(fēng)、羌活;風(fēng)濕熱痹加茯苓、石膏;瘀血閉阻加紅花、地龍;肝腎虧虛偏陰虛加山茱萸、牛膝;偏陽虛加附子、肉桂;取汁300 mL。藥液濃縮成6 g/mL;美洛昔康膠囊，7.5 mg，四川寶光藥業(yè)，國準(zhǔn)字:H20010209，批次:120502770265，配成0.5 mg/mL 溶液。

1.3 主要試劑及儀器

SD 大鼠IL-1、iNOS ELISA 試劑盒(規(guī)格:96T，Abcam US，批號:AB22031)，顯色劑顯色(DAB 等)，采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法檢測血清軟骨及滑液標(biāo)記物;酶聯(lián)免疫檢測儀(ELX-800 US)、96 孔板(Costar US);Retsch 德國干燥箱(型號:TG100，Germany RETSCH Company);恒溫水箱(DDIL-5 型，上海安亭科學(xué)儀器廠);石蠟切片機(jī)(u-641 型，美國貝克曼公司);光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)(BH-5 型日本Olympus 公司);全自動圖像分析系統(tǒng)(MCS-7200，德國Leica);723 分光光度計(ELX8086 型，美國寶特公司);數(shù)碼X 光機(jī)(DR-500，美國GE 公司)。

2 實驗方法

2.1 模型制備

實驗動物隨機(jī)分為正常組、模型組(生理鹽水組)、美洛昔康組及補(bǔ)腎固筋方組，每組11 只，除正常組外均采用改良Hulth 造模［4］。10%水合氯醛，0.3～0.4 mL/100g 腹腔注射麻醉，先注射總量的2/3 隨后根據(jù)情況適當(dāng)追加10%水合氯醛0.2～0.5 mL 直至麻醉成功。右后肢膝關(guān)節(jié)外側(cè)縱切口長約5 cm，逐層切開、分離，探查關(guān)節(jié)腔無原發(fā)病變后，完整切除內(nèi)側(cè)半月板、ACL(Anterior Cruciate Ligament)及MCL(Medial Collateral Ligament)，造成負(fù)重力線內(nèi)移及膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)。術(shù)側(cè)肢體不固定，術(shù)后肌注青霉素160 萬IU/(kg·d)，連續(xù)8 d，每隔1 d 觀察創(chuàng)口愈合情況，預(yù)防感染。術(shù)后第7 d 開始強(qiáng)迫大鼠奔跑(1.5 h/d)。當(dāng)脛股關(guān)節(jié)面正常外翻10°變?yōu)閮?nèi)翻，X 射線片顯示下肢力線改變明顯跛行明顯，表示造模成功。造模3 周軟骨出現(xiàn)改變，7 周后進(jìn)入平臺期，11 周出現(xiàn)典型的晚期OA 病理改變。造模成功率為86%。

2.2 干預(yù)方法

造模3 周后開始干預(yù)，人與動物的體表面積計算法換算:SD 大鼠每日藥量(2.5 kg)=成人(60 kg)每日藥量×0.04 ×2.5 ×1/3，正常組、模型組鼻飼胃管注射10 mL 生理鹽水，2 次/d;美洛昔康每日藥量約為4 mg/kg，補(bǔ)腎固筋方每日藥量為43 g/kg，每天兩次鼻飼胃管注射。連續(xù)干預(yù)12 周。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 步態(tài)觀察

David Coderre 步態(tài)分級［5］評價。0 級:正常行走，行走時間＞5 min;Ⅰ級:輕微跛行，行走時間3～5 min;Ⅱ級:中度跛行，行走時間＜3min。

2.3.2 形態(tài)學(xué)觀察及IL-1、iNOS 檢測

頸椎脫臼法處死后1 mL 生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，取脛骨內(nèi)側(cè)軟骨面，肉眼觀察SD 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面情況，切取膝關(guān)節(jié)前方部分滑膜組織和股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，剪成約0.5 cm ×0.6 cm ×0.3 cm 組織塊，病理切片(5 μm)，HE 染色，形態(tài)學(xué)觀察關(guān)節(jié)軟骨的層次、軟骨細(xì)胞及軟骨下骨變化;空腹取血5 mL，5000 rpm 離心10 min 分離血清，-60℃冰箱保存。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)比較

正常組軟骨藍(lán)白色，色澤透明，觸之較硬，關(guān)節(jié)液量少;模型組滑膜腫脹，關(guān)節(jié)邊緣與滑膜有少許纖維性粘連凹凸不平;兩個給藥組關(guān)節(jié)軟骨呈白色，欠光滑，滑膜輕度增生，關(guān)節(jié)液較正常組稍多，滑膜炎性表現(xiàn)較模型組輕。

3.2 X 射線比較

頸椎脫臼法處死動物前拍攝SD 大鼠膝關(guān)節(jié)正位DR(Digital Radiography)片，David T［6］法分級:0度:未見異常;Ⅰ度:可疑;Ⅱ度:肯定;Ⅲ度:明顯硬化。Lane-Sandhu X 線評分［7］。正常組大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙均勻一致，關(guān)節(jié)面平整，邊緣整齊規(guī)則無骨贅，關(guān)節(jié)內(nèi)無游離體;模型組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙變窄外側(cè)間隙增大，骨囊變、骨贅形成;美洛昔康組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙介于模型組和中藥組之間，有輕微骨贅形成;補(bǔ)腎固筋方組膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間隙狹窄不明顯，未見明顯骨贅形成。

圖1 正常組(A)、模型組(B)、美洛昔康組(C)及補(bǔ)腎固筋方組(D)的膝關(guān)節(jié)正位DR 片F(xiàn)ig.1 Knee anteroposterior X-rays of normal group (A)，model group (B)，meloxicam group (C)and BSGJP group (D)

表1 造模成功后6、12 周Lane-Sandhu X 射線評分(Mean±SD，n=11)Table 1 Lane-Sandhu X scores at 6，12 weeks after the modeling (Mean±SD，n=11)

3.3 形態(tài)學(xué)比較

如圖2 所示，正常組膝關(guān)節(jié)軟骨藍(lán)白色透明，表面光滑，觸之適中，關(guān)節(jié)液量正常;模型組滑膜腫脹，軟骨表面渾濁淡黃色不光滑觸之較硬，關(guān)節(jié)邊緣與滑膜有少許纖維性粘連，鏡下軟骨細(xì)胞排列不完整呈深層簇聚;美洛昔康藥和補(bǔ)腎固筋方組關(guān)節(jié)軟骨白色光滑，滑膜輕度增生，關(guān)節(jié)液較模型組少，兩組滑膜炎性表現(xiàn)較模型組輕。電鏡下模型組較美洛昔康組軟骨細(xì)胞排列欠規(guī)整、簇狀增生明顯，補(bǔ)腎固筋方組較正常組軟骨細(xì)胞完整且排列整齊。

圖2 正常組(A)、模型組(B)、美洛昔康組(C)及補(bǔ)腎固筋方組(D)大鼠膝關(guān)節(jié)脛骨關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨面情況(HE，×40)Fig.2 Knee medial tibial articular cartilage of rats from normal group (A)，model group (B)，meloxicam group (C)and BSGLP group (D)(HE，×40)

3.4 IL-1、iNOS 比較

與正常組比較，模型組血清及關(guān)節(jié)液IL-1、iNOS含量升高(P＜0.01)。兩個給藥組與模型組比較血清及關(guān)節(jié)液IL-1、iNOS 含量降低(P＜0.01)，兩個給藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)(表2)。

表2 血清及關(guān)節(jié)液IL-1、iNOS 含量比較(Mean±SD)Table 2 Concentration of interleukin-1，inducible nitric oxide synthase content of serum and synovial fluid (Mean±SD)

4 討論

Evan G 和Little wood T［8］在1983 年首先報道了在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)和骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)中都可檢測到IL-1的存在;IL-1 可誘發(fā)慢性滑膜炎，軟骨基質(zhì)降解產(chǎn)物的刺激也可引起滑膜的繼發(fā)炎癥［9］，促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌前列腺素(PGE2Prostaglandins 2)［10］，刺激骨吸收及成骨細(xì)胞增生鈣化，軟骨下骨增厚骨贅生成［11］。OA 軟骨免疫組化染色的基質(zhì)及細(xì)胞中IL-1、iNOS 及其受體均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，強(qiáng)度與范圍和OA 嚴(yán)重程度相對應(yīng)［12］;IL-1、iNOS 促進(jìn)多形核細(xì)胞，刺激滑膜細(xì)胞的PGE2分泌，增加骨軟骨的破壞，IL-1、iNOS 促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增殖，增強(qiáng)RNA 的表達(dá)功能，最終滑膜組織纖維性變性，IL-1、iNOS 相互協(xié)同，加快了膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的破壞［13］。

治則補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋健骨，熟地、補(bǔ)骨脂為君藥，熟地性微溫、味甘，滋陰養(yǎng)血，補(bǔ)骨脂是補(bǔ)腎壯陽益精填髓之要藥，熟地、補(bǔ)骨脂和枸杞子配伍改善微循環(huán)與血液流變學(xué)，降低骨內(nèi)壓，緩解骨和骨髓血流動力學(xué)及其引起的代謝異常［14］，更有利于促進(jìn)軟骨修復(fù);臣藥巴戟天、川牛膝和雞血藤改善軟骨細(xì)胞功能，促進(jìn)軟骨修復(fù)，刺激軟骨破壞區(qū)產(chǎn)生大量幼稚軟骨［15］，減少或阻斷因軟骨片丟失刺激滑膜分泌［16，17］;木瓜、丹參活血化瘀藥可以促進(jìn)關(guān)節(jié)內(nèi)外的血液循環(huán)，改善靜脈瘀滯狀態(tài)，降低骨內(nèi)壓［18］。研究中觀察到治療12 周后羊關(guān)節(jié)積液明顯減少，X線片示骨端變性，軟骨下骨質(zhì)萎縮，狹窄的間隙明顯增寬，中藥組滑膜組織TNF-α、iNOS 含量降低，OA滑膜進(jìn)一步變性對滑膜增殖及RNA 的表達(dá)有促進(jìn)作用;對照組則相反。補(bǔ)腎固筋方減少TNF-α、iNOS的分泌對軟骨和滑膜的侵害，抑制滑膜炎性改變，同時滑膜滲透作用于軟骨細(xì)胞增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的代償能力，修復(fù)并延緩軟骨退變、促進(jìn)軟骨修復(fù)。

1 The Administration of TCM (國家中醫(yī)藥管理局).TCM Syndrome Diagnostic Efficacy of the Standard (中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)).Nanjing:Nanjing University Press，1999.48-55.

2 Fitzgerald GK，White DK，Piva SR.Associations for change in physical and psychological factors and treatment response following exercise in knee osteoarthritis:an exploratory study.Arthritis Care Res，2012，64:1673-1680.

3 Cui XN (崔向?qū)?，Li YB (李玉波)，Li Y(李妍)，et al.The influence of brain tumor necrosis factor-α，nuclear transcription factor-KB and aquaporin-4 expression in rats with cerebral hemorrhage.Chin Integr Med (中國中西醫(yī)結(jié)合雜志)，2015，2:513-515.

4 Hulth A，Lindberg L，Telhag H.Experimental osteoarthritis in rabbits.J Acta Orthop Scand，1970，41:522-530.

5 Coderre D，Le Marechal H，Ekindjian OG，et al.Nitric oxide modifies glycolytic pathways in cultured human’s，iNOS viocytes.Cell Biol，2008，2:285-286.

6 David T，Atkins CM，Allen MT，et al.Inhibition of nitric oxide synthesis impairs two different forms of learning.Neuworeport，2012，3:567-570.

7 Bradbury N，Hutchinson J，Hahn D，et al.Clavicular nonunion.31/32 healed after plate fixation and bone grafting.Acta Orthopaedica Scandinavica，1996，67:367-370.

8 Wood H，Geroganas C，Pagliari LI，et al.Bcl-2 expression in syvial fibroblast is essential for maintaining mitochondrial homeostasis and cell viability.J Immunol，2000，164:5227-5235.

9 Parmelee PA，Harralson TL，McPherron JA，et al.The structure of affective symptomatology in older adults with osteoarthritis.Int J Geriatr Psychiatry，2013，28:393-401.

10 Venkataramanan V，Gignac MA，Dunbar M，et al.The importance of perceived helplessness and emotional health in understanding the relationship among pain，function，and satisfaction following revision knee replacement surgery.Osteoarthritis Cartilage，2013，21:911-917.

11 Racine J，Aaron RK.Pathogenesis and epidemiology of osteoarthritis.R I Med J，2013，96(3):19-22.

12 Li X (李旭)，Wang HL(王海立)，Zhu L(朱煉)，et al.The effection of long-term impact on bilateral after complete resection of unilateral line patellar fragility fractures.J Orthopaedic Trauma(中華創(chuàng)傷骨科雜志)，2013，11:928-931.

13 Wang HL，Zhu L.The effection of long-term impact on bilateral after complete resection of unilateral line patellar fragility fractures.J Orthopaedic Trauma，2013，11:928-931.

14 Qu W(曲偉)，Wang MJ(王孟君)，Yu HY(于海燕)，et al.Study on the antioxidant activity of Maojian tea polysaccha-rides and its conjugate.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2015，27:210-213.

15 Li Z(李智)，Yu JY(于金英)，Jiang Y(蔣瑤)，et al.Optimization of matrix recipe of Bitongting cataplasm by Box-Behnken design.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2015，27:226-231.

16 Ji WF (季衛(wèi)鋒).Experimental study of osteoarthritis prevention act rat knee.J Chin Orthopedics (中國骨傷)，2012，28:246-250.

17 Xu F(許峰)，Zhang GH(章光華)，Li HH(李歡華).Juan hunchback pill treatment of postmenopausal osteoporosis with 37 cases.J Tradit Chin Med(中醫(yī)雜志)，2013，12:117-118.

18 Li L(李麗)，Qiu QY(邱全瑛)，Wu WJ (吳王君)，et al.The experimental research on particle immunomodulatory effects in DTH Mice circulation Juanbi painless granules.J Beijing Univ Tradit Chin Med (北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報)，2013，22(5):67-70.