北細辛揮發油對5 種鐮刀菌的抑菌活性及其成分分析

于婷婷，李 強，王茂青，何 朋，尚 坤，吳秀菊*

1東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030;2 黑龍江省農墾總局科研育種中心，哈爾濱 150036

馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是我國重要的經濟作物，其產量和種植面積隨產業結構的調整逐年增加［1］，而塊莖腐爛是影響馬鈴薯產量和品質的主要限制因素之一，其中由鐮刀菌引發的干腐病是馬鈴薯貯藏期間引起塊莖腐爛最常見的病害，可導致窖儲損失率高達60%，造成重大經濟損失［2，3］。目前防治馬鈴薯干腐病的方法主要是在貯藏過程中保持干燥通風及以奧力克-霉止、多菌靈等農藥消毒種薯，但隨之會產生病原菌抗藥性、農藥長時間殘留、高毒性、高污染等問題［4，5］。因此開發環境友好、作用方式特異、對非靶標生物相對安全等特點的植物源農藥倍受人們的關注［6，7］。

北細辛又名遼細辛，為馬兜鈴科細辛屬多年生藥用植物，除具有解熱、鎮靜、鎮痛等藥效外［8］，還有良好的殺蟲作用和一定的抗菌活性［9-11］。近年來研究表明，北細辛獨特的藥理作用，主要與其揮發油有關［12］。北細辛揮發油對灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)等5 種黃瓜致病菌、茄子黃萎病致病菌大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb)、4 種人參致病菌均有良好的抑制效果［13-15］。作為植物源農藥，北細辛具有一定的開發應用前景。

本試驗探究了北細辛揮發油對5 種馬鈴薯干腐病致病菌鐮刀菌的抑菌效果，以期為馬鈴薯干腐病的有效防治和基于北細辛的植物源農藥開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物北細辛(遼細辛)購于黑龍江省藥材市場，經黑龍江省中醫藥大學王振月教授鑒定為馬兜鈴科細辛屬北細辛。供試菌種為引起馬鈴薯干腐病的5 種病原菌，分別為擬枝孢鐮刀菌(Fusarium sporotrichioides)、擬絲孢鐮刀菌(F.trichothecioides)、黃色鐮刀菌(F.culmorum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、茄病鐮刀菌藍色變種(F.solani var.coeruleum)。5 種病原菌均由東北農業大學李鳳蘭老師提供，保存于本實驗室。

供試培養基為PDA 培養基和VBC 培養基。

1.2 方法

1.2.1 揮發油的提取

北細辛全株陰干，用粉碎機粉碎后過40 目篩，放在通風干燥處備用。稱取100 g 粉末，以1∶10 的料液比加入1000 mL 蒸餾水，超聲輔助浸提60 min后，用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，重復3 次，揮發油提取率為2.1%。揮發油置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 菌種的活化

將保存在4 ℃的5 種鐮刀菌于室溫下恢復幾分鐘，然后挑取少量菌絲接種于PDA 培養基上，并置于25～28 ℃恒溫培養箱中培養，待用。

1.2.3 揮發油對菌絲生長活性的抑制作用

采用菌絲生長速率法，用適量吐溫60 助溶揮發油后，加入到PDA 培養基中，配成質量濃度為1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313 g/L 的培養基，以等體積的吐溫60 作為對照(CK)，充分搖勻后，倒入培養皿中制成平板。待凝固后，每個平板中央接入1 個直徑0.5 cm 的菌餅，每一菌種、每個梯度設3個重復。然后置于25～28 ℃的恒溫培養箱中培養，96 h 后采用十字交叉法測菌落直徑，取平均值，按下式計算菌絲抑制率。

菌絲抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-0.5)×100%

以菌絲抑制率為橫坐標，揮發油質量濃度為縱坐標，繪制毒力回歸方程，并計算得出半抑制濃度IC50。

1.2.4 揮發油對鐮刀菌孢子萌發的抑制作用

以VBC 培養基誘導產生大量孢子，采用凹玻片法測定孢子的萌發率。具體做法是取在VBC 培養基上培養6～7 d 的鐮刀菌，以無菌水將孢子沖洗下，用4 層紗布過濾，將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液，調節其濃度，在10 ×10 低倍鏡下觀察，每個視野50～60 個孢子。用少量吐溫60 溶解揮發油，與孢子懸液混合配成質量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 g/L 的孢子懸液，以無菌水作為空白對照。在凹玻片上分別滴入1 滴含不同質量濃度揮發油的孢子懸浮液。將凹玻片放在一個含有吸水濾紙的培養皿中，置于25～28 ℃培養箱中，12 h 后鏡檢，觀察孢子萌發情況，統計100～150 個孢子，每個處理重復3次。按下列公式計算孢子萌發率和孢子抑制率。

孢子萌發率(%)=萌發孢子數/總孢子數×100%

孢子抑制率(%)=(對照組萌發率-處理組萌發率)/對照組萌發率×100%

以孢子抑制率為橫坐標，揮發油質量濃度為縱坐標，繪制毒力回歸方程，并計算得出IC50。

1.2.5 地上部分和地下部分揮發油的提取

分別以水蒸氣蒸餾法和超聲輔助浸提法對北細辛地上部分和地下部分進行揮發油的提取，獲得A(地上部分水蒸氣蒸餾法)、B(地下部分水蒸氣蒸餾法)、C(地上部分超聲輔助浸提法)和D(地下部分超聲輔助浸提法)等4 組揮發油。每次稱取50 g 植株粉末，每組設3 次重復。揮發油經無水硫酸鈉干燥后，以安捷倫7890A-5975c 氣相色譜-質譜聯用儀進行GC-MS 分析。GC-MS 分析條件參照李凡海等［16］。

1.3 數據分析

應用SPSS 17.0 統計分析軟件對試驗數據進行方差分析，并進行Duncan’s 多重比較。

2 結果與分析

2.1 揮發油對5 種鐮刀菌菌絲生長的影響

采用二倍稀釋法設置濃度梯度，考察不同濃度揮發油對5 種鐮刀菌菌落直徑的抑制作用。由表1可以看出，0.0313～1 g/L 的揮發油均可抑制供試鐮刀菌的菌落直徑，抑制效果隨揮發油質量濃度的升高而增加。與對照(不加揮發油)相比，當揮發油濃度為0.0313 g/L 時，對供試鐮刀菌菌落直徑的抑制作用均達極顯著水平(P＜0.01)。可見，北細辛揮發油對供試鐮刀菌有良好的抑制作用。

由表1 可知，隨著質量濃度的增加，北細辛揮發油對5 種鐮刀菌菌絲生長的抑制作用明顯增強。通過5 個線性毒力回歸方程(y=ax +b)，得出半抑制濃度(IC50)均小于0.5 g/L，說明北細辛揮發油對5種供試鐮刀菌菌絲生長均具有較強的抑制作用。比較半抑制濃度IC50，燕麥鐮刀菌＜黃色鐮刀菌＜擬絲孢鐮刀菌＜擬枝孢鐮刀菌＜茄病鐮刀菌藍色變種。其中，對燕麥鐮刀IC50為0.148 g/L，說明揮發油對燕麥鐮刀菌菌絲生長的抑制效果最顯著;其次為對黃色鐮刀菌、擬絲孢鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌，IC50在0.228～0.333 g/L;對茄病鐮刀菌藍色變種菌絲生長的抑制作用最弱，IC50為0.387 g/L。當揮發油質量濃度為1 g/L 時，對燕麥鐮刀菌、黃色鐮刀菌具有殺菌的作用。

表1 揮發油對5 種鐮刀菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of essential oil on the mycelial growth of five Fusariums

2.2 揮發油對5 種鐮刀菌孢子萌發的影響

由表2 可知，北細辛揮發油對5 種鐮刀菌孢子萌發均有明顯的抑制作用，除茄病鐮刀菌藍色變種外，對其它4 種鐮刀菌的IC50均小于0.5 g/L。隨著揮發油濃度的增加，萌發率減小，抑制率增加。比較半抑制濃度IC50，燕麥鐮刀菌＜擬枝孢鐮刀菌＜黃色鐮刀菌＜擬絲孢鐮刀菌＜茄病鐮刀菌藍色變種，說明揮發油對燕麥鐮刀菌孢子萌發的抑制效果最好。

表2 揮發油對5 種鐮刀菌孢子萌發的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of A.heterotropoides essential oil on the germination of Fusarium spores

注:“x”代表抑制率，“y”代表揮發油濃度。Note:“x”represents the inhibition rate，“y”represents concentration of essential oil.

2.3 不同提取方法下地上部分和地下部分揮發油提取率的比較

采用水蒸氣蒸餾法和超聲輔助浸提法分別對地上部分和地下部分揮發油進行提取，每次稱取50 g樣品，每組設3 次重復，結果如表3 所示。可知，地下部分揮發油含量明顯高于地下部分，且超聲輔助浸提法提取率更高，而且出油很快，大大縮短了提取時間，從而節省了工藝時間。

表3 四組揮發油提取率的比較Table 3 Comparison of extraction rates of 4 groups of essential oils

2.4 GC-MS 分析結果

各取4 種北細辛揮發油1 μL 注入GC-MS 聯用儀進行分析，得到4 個總離子流色譜圖，見圖1。通過檢索NIST 05 標準譜庫，并結合質譜裂解規律進行核對，共鑒定出51 種成分，并采用峰面積歸一法計算各化學成分的相對含量，結果見表4。

其中，地上部分水蒸氣蒸餾法揮發油中分離出74 個化學成分，鑒定了32 個成分，已鑒定成分占揮發油總量的96.081%;地下部分水蒸氣蒸餾法揮發油中分離出61 個化學成分，鑒定出31 個成分，已鑒定成分占揮發油總量的95.713%;地上部分超聲輔助浸提法揮發油中分離出105 個化學成分，鑒定出36 個成分，已鑒定成分占揮發油總量的94.858%;地下部分超聲輔助浸提法揮發油中分離出42 個化學成分，鑒定出28 個成分;已鑒定成分占揮發油總量的98.374%。4 種揮發油中共有18 種相同成分，其中包括甲基丁香酚、黃樟醚、3，4，5-三甲氧基甲苯、3，5-二甲氧基甲苯、優香芹酮等，分別占4 種揮發油含量的66.5%、81.54%、66.85%、85.44%。可見地下部分揮發油中主要成分比地上部分含量高。

圖1 地上部分水蒸氣蒸餾法(A)、地下部分水蒸氣蒸餾法(B)、地上部分超聲輔助浸提法(C)及地下部分超聲輔助浸提法(D)提取揮發油總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of essential oils of aerial (A)or underground (B)part extracted by steam distillation and aerial(C)or underground (D)part extracted by ultrasonic-assisted extraction

表4 四組揮發油成分的GC-MS 分析結果Table 4 Chemical composition of four groups of essential oils

注:“-”表示未檢出。Note:“-”represents not detected.

3 討論

由鐮刀菌引發的馬鈴薯干腐病發病率高，危害嚴重。目前主要依靠化學農藥進行防治。雖然防治效果顯著，但病原菌極易產生抗藥性，同時危害對人類健康和環境。而植物源農藥來源于植物，污染較小，易降解，使用效果好，是發展綠色農業的理想農藥。但是相關研究主要集中在殺蟲劑類，而對殺菌劑研究較少。因此，不斷開發新的植物源殺菌劑成為當務之急。揮發油是植物源農藥中研究比較廣泛一類化合物。已有報道細辛揮發油可以有效抑制番茄早疫病菌、茄子枯萎病菌等多種病菌［17，18］。本研究發現北細辛揮發油對馬鈴薯干腐病致病菌鐮刀菌的抑菌效果顯著，且抑制作用與揮發油質量濃度呈劑量依賴性。說明北細辛揮發油可有效防治馬鈴薯干腐病，可將北細辛開發為植物源農藥。

比較看來揮發油對供試菌絲生長與孢子萌發的抑制效果有所不同，孢子萌發的抑制試驗中，抑制效果擬枝孢鐮刀菌＞黃色鐮刀菌＞擬絲孢鐮刀菌，而在菌絲生長的抑制試驗中，黃色鐮刀菌＞擬絲孢鐮刀菌＞擬枝孢鐮刀菌。

揮發油GC-MS 結果顯示，其主要成分與前人研究大致相同［16，19］，其中甲基丁香酚含量最高。本研究發現地下部分超聲輔助浸提法中甲基丁香酚的含量近于50%，甲基丁香酚為北細辛主要的藥用成分，其提取方法的優化對于提高北細辛的利用率具有重要意義。不同栽培技術、存放時間、產地、提取方法等對揮發油的有效成分均有所影響［20］。4 組揮發油雖然有18 種共同成分，但是其他成分及含量存在差異，說明提取方法及地上部分與地下部分所含成分不同所致。

本研究尚未對北細辛揮發油抑菌機制、4 種揮發油的抑菌活性比較進行系統性的探討，對其抑菌活性成分也尚未明確。下一步將對北細辛揮發油作用后致病菌菌絲和孢子形態、生理生化指標以及致病菌基因和蛋白表達水平變化等方面進行深入研究，進一步闡明北細辛揮發油的抑菌機制，為北細辛揮發油的實際應用提供理論指導。

4 結論

以水蒸氣蒸餾法對北細辛全株提取的揮發油對5 種供試鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發均有較強的抑制作用，且抑制作用與揮發油質量濃度呈劑量依賴性。說明北細辛揮發油可有效抑制馬鈴薯干腐病鐮刀菌，可進一步開發成為植物源農藥。

采用水蒸氣蒸餾法、超聲輔助浸提法提取北細辛揮發油，通過GC-MS 分析，鑒定出的成分占各揮發油的含量均達94%以上。初步鑒定出51 種成分，其中地上部分水蒸氣蒸餾法中32 種，地下部分31 種;地上部分超聲輔助浸提法中36 種，地下部分28 種。

地下部分揮發油提取率高于地上部分，揮發油以甲基丁香酚和黃樟醚為主要成分，因此推測兩種物質為北細辛產生抑菌作用的有效成分。

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