RP-HPLC 法同時測定頤腦解郁顆粒中梔子苷和五味子醇甲

趙衛云 ，孫耀志，高 松，楊 玲，王瑞娜，馮德文

1河南中醫學院藥學院;2 河南省宛西制藥股份有限公司研發部，鄭州 450000

頤腦解郁顆粒來源于北京中醫藥大學第三附屬醫院唐啟盛教授的驗方，本方由梔子、五味子、郁金、刺五加四味中藥組成。具有益腎調氣、解郁安神的作用，在臨床上常用于腎精不足，肝氣郁滯所致抑郁癥者。方中梔子對中樞神經系統具有鎮痛鎮靜的作用［1］，環烯醚萜類化合物是梔子中的主要活性成分，其所含的梔子苷可作為本顆粒質量控制的指標成分。五味子中含有的多種木脂素成分被認為是五味子中最主要的藥理活性成分，其所含的五味子醇甲具有廣泛的中樞抑制作用和神經保護作用［2，3］。采用HPLC 法單獨測定梔子苷、五味子醇甲的文獻已有報道［4-8］，但在同一色譜條件下實現這2 種組分同時測定的方法尚未見報道。本實驗采用梯度洗脫，可一次進樣同時檢測上述2 種成分，檢測效率高，且精密度、穩定性等方法學考察均符合要求，可為頤腦解郁顆粒質量標準的制定提供可靠的依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);AL104 電子天平和MS105 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

梔子苷對照品(批號:0749-200007)、五味子醇甲對照品(批號:110857-201211)，均購自中國食品藥品檢定研究院;頤腦解郁顆粒(批號:20130301、20130401、20130501)為宛西制藥研發部自制;甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～12 min，30% A;12～20 min，30%～60% A;20～40 min 60%A)，體積流量1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長為238 nm(0～20 min)，250 nm(20～40 min)。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取梔子苷與五味子醇甲對照品適量，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻配置1 mL 含梔子苷0.1432 mg、五味子醇甲0.0513 mg 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備

按頤腦解郁顆粒的處方比例和制備工藝，分別制備缺梔子和缺五味子的陰性制劑，按2.2.2 項供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按2.1 項下色譜條件進行測定。陰性對照色譜圖中，在與供試品及對照品色譜圖中相應的保留時間處無色譜峰出現，表明陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 混合對照品(A)、頤腦解郁顆粒供試品(B)、缺五味子陰性樣品(C)及缺梔子陰性樣品(D)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A)，Yinao Jieyu Granules (B)，negative sample without Schisandrae Chinensis Fructus (C)and negative sample without Gardeniae Fructus (D)

2.3.2 線性關系考察

分別精密吸取2.2.1 項下混合對照品溶液2、4、6、8、12、16、20 μL，依次進樣，按照2.1 項下色譜條件測定峰面積。以對照品的進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程:梔子苷Y=1469.71X+74.39;相關系數r=0.9997。表明梔子苷的含量在0.2864～2.8640 μg 之間，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。五味子醇甲Y=2077.52X +7.21;相關系數r=0.9999。表明五味子醇甲的含量在0.1062～1.0620 μg 之間，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，按上述色譜條件連續進樣6 次，梔子苷、五味子醇甲峰面積RSD分別為1.16%、1.35%。

2.3.4 穩定性試驗

取同一供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h 進樣10 μL，測定峰面積，梔子苷、五味子醇甲峰面積RSD 分別為1.64%、1.82%。表明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.3.5 重復性試驗

取同一批樣品，按2.2.2 項供試品溶液的制備方法平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件進樣10 μL，測定梔子苷、五味子醇甲的峰面積，計算得梔子苷的平均質量分數為8.50 mg/g，RSD 為1.36%，五味子醇甲的平均質量分數為2.84 mg/g，RSD 為1.62%。表明本實驗方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

稱取已知含有量的樣品0.5 g，平行6 份，精密稱定，分別精密加入梔子苷和五味子醇甲混合對照品溶液(含梔子苷0.4242 mg/mL 和五味子醇甲0.1401 mg/mL)10 mL，按2.2.2 項供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣10 μL，測定峰面積，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)Table 1 Results of recovery tests (n=6)

2.4 樣品測定

取3 批樣品，分別按2.2.2 項下方法制備樣品溶液，照2.1 項下條件測定，計算供試品中梔子苷和五味子醇甲的含量，結果見表2。

表2 樣品測定結果(n=3)Table 2 Contents of jasminoidin and schisandrae detected in 3 batches of samples (n=3)

3 討論

3.1 測定波長的選擇

頤腦解郁顆粒中梔子苷和五味子醇甲這2 種指標成分的最大吸收波長不同，通過紫外全波長掃描的光譜圖可知，梔子苷在238 nm 處有最大吸收，五味子醇甲在250 nm 處有最大吸收。試驗中曾考察用同一個波長測定這兩個指標成分，發現分離效果不是很好，故選擇雙波長法，使這兩個指標成分在各自最大吸收波長下測定，以獲得最佳的檢測效果。

3.2 流動相的選擇

本實驗考察了不同溶劑系統，如乙腈-水、甲醇-水對色譜峰分離效果的影響。結果表明以不同比例的乙腈-水為流動相的分離效果不是很理想，以甲醇-水進行梯度洗脫，可將待測組分完全分離，縮短分析時間。故選擇甲醇-水作為流動相。

3.3 提取條件的選擇

試驗過程中對供試品溶液的處理方法進行了考察，首先采用超聲提取和回流提取這兩種方法進行考察。結果表明:兩種提取方法的提取效率比較接近，但超聲提取方法操作簡便、快捷，故本實驗確定以超聲處理作為提取方法。又分別采用甲醇、乙醇、水這三種不同的溶劑超聲提取，并對不同提取時間進行比較試驗，實驗中將樣品分別超聲20、30、40 min 后測定梔子苷和五味子醇甲的含量。結果表明，用甲醇作溶劑，超聲30 min 處理樣品為最佳，可使樣品中的梔子苷和五味子醇甲提取完全。

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