二維制備高效液相色譜分離塞隆骨強極性多肽

江 磊 ，趙 換，陶燕鐸，王 碩，邵 赟，王啟蘭，張耀洲，梅麗娟*

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;2 瀚盟生物技術(天津)有限公司;3天津大學藥學院，天津 300072;4 中國科學院大學，北京 100049

塞隆骨藥材是一種名為高原鼢鼠的嚙齒目動物的風干骨骼。塞隆骨藥材廣泛使用于青藏高原地區(qū)。1991 年塞隆骨藥材被國家藥監(jiān)局批準成為新中國第一個用于治療類風濕關節(jié)炎等病癥的動物類一類新藥材，并進入中國藥典。隨后以塞隆骨單味藥制成的塞隆風濕酒取得了中藥一類新藥的新藥批準文號，在2000 例的臨床實驗中起效率超過90%。除了具備抗類風濕關節(jié)炎［1］的功效，塞隆骨還具備抗骨質(zhì)疏松［2］、止痛［3］和抗炎［4］的功效。由于塞隆骨藥材的化學成分過于復雜，幾乎沒有關于塞隆骨藥材化學成分的研究結果發(fā)表。為了研究塞隆骨這種復雜動物類藥材的化學組成，天然產(chǎn)物研究領域急需開發(fā)一種先進的針對動物組織提取物的分離方法。

在前期研究中，塞隆骨的分離工作使用傳統(tǒng)柱層析進行。傳統(tǒng)方法分離的結果非常不理想。究其原因有二:首先這些傳統(tǒng)分離方法都是針對植物提取物設計的，并不適用于動物藥的分離純化。其次這些傳統(tǒng)方法由于重復性差、分辨率低和柱效低等缺點，沒有能力分離塞隆骨這樣的復雜混合物。為了分離塞隆骨混合物，本研究團隊不得不尋求更高分離能力的分離方法。

制備型高效液相色譜由于具備高柱效、重復性優(yōu)異以及高自動化等特點，非常適合并且有能力分離復雜天然產(chǎn)物提取物。在許多天然產(chǎn)物研究中高效液相色譜往往是作為最后一步最精細的純化方法使用［5］。但是面對復雜的塞隆骨提取液，僅僅使用一維高效液相色譜不能將塞隆骨混合物分離成單體化合物。因此，想要得到塞隆骨單體化合物必須使用多維高效液相色譜。所謂的多維色譜指的是使用多根具備一定正交性的高效液相色譜柱進行配合分離的色譜系統(tǒng)。一旦正交體系形成，多維色譜的分離能力將比一維色譜提升數(shù)倍至數(shù)十倍。這種具備強分離能力的多維色譜適合用于分離塞隆骨提取物［6-9］。但是，如何選擇相互正交的色譜柱、如何控制色譜流速、檢測波長、上樣量等色譜分離的必須參數(shù)并不清楚。為了使用二維色譜分離塞隆骨混合物，本文將建立新型的系統(tǒng)的二維分離方法對塞隆骨提取液進行色譜分離。此方法不僅僅適用于塞隆骨的分離純化，還可以應用于其他類似的動物藥材分離分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品塞隆骨采自青海省海東地區(qū)，由中國科學院西北高原生物研究所副研究員高級工程師梅麗娟鑒定為高原鼢鼠骨骼。甲醇、乙腈為天津康科德有限公司提供。

1.2 儀器

制備型高效液相色譜:配備兩臺100 mL 柱塞桿20 Mpa 高壓液相泵、紫外檢測器、六通閥進樣器和博納艾吉爾高效液相系統(tǒng)軟件(博納艾吉爾，天津)。

半制備高效液相系統(tǒng):配備兩臺50 mL 柱塞桿20 Mpa 高壓液相泵、紫外檢測器、六通閥進樣器和博納艾吉爾高效液相系統(tǒng)軟件(博納艾吉爾，天津)。

分析型高效液相系統(tǒng)使用日立高效液相系統(tǒng):配備日立L2130 四元高壓泵、日立L2400 紫外檢測器、日立L2200 自動進樣器和日立Lachrom Elite 高效液相軟件(日立，日本)。

質(zhì)譜系統(tǒng)采取納升級超高效液相色譜與離子肼質(zhì)譜(熱電，美國)聯(lián)用的方式(LTQ-XL);質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)分析使用軟件Thermo Proteome Discover 1.2 的SEQUEST 算法(熱電，美國)。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

1 kg 新鮮塞隆骨首先在-80 ℃中預凍24 h，然后置入-40 ℃超低溫冷凍粉碎機中冷凍粉碎。冷凍粉碎機將塞隆骨原料粉碎至150 目左右后，將冰凍粉末迅速按照1∶20 的料液比置入100 ℃熱水中攪拌1 h。加熱攪拌結束后將提取液離心取上清液，離心機轉速12000 rpm，離心時間40 min。隨后將離心上清液置于70 ℃旋轉蒸發(fā)儀中進行濃縮，并將濃縮液置入4 ℃環(huán)境中24 h。將4 ℃的濃縮液過0.45 μm 濾膜后得到色譜樣品。此時樣品濃度為30.7 mg/mL。

2.2 樣品前處理

色譜樣品首先使用SPE 固相萃取柱進行前處理。SPE 固相萃取柱柱材料為C18(50 μm，120 ?，日本大曹)。首先用純甲醇活化SPE 柱，然后用5%甲醇-水(v∶v)溶液平衡SPE 柱后上樣。上樣后先用5%甲醇-水(v∶v)溶液沖洗SPE 柱，然后用10%甲醇-水(v∶v)溶液洗脫此樣品中的大極性組份。收集此大極性組份并將樣品濃縮、過膜。過膜后的樣品濃度為255.7 mg/mL。此大極性混合物樣品即為本文主要研究對象。

2.3 色譜條件

第一維制備色譜在制備型高效液相色譜儀上使用C18AQ 制備色譜柱(50 ×250 mm i.d.，10 μm，120 ?，YMC)。流動相使用水(A)-甲醇(B)體系。線性洗脫方法為:0～15 min，1% B;15～30 min，1%～10% B。流速為80 mL/min。進樣量為4 mL。紫外檢測波長為214 nm。通過第一維色譜將混合物分成了若干次級組份。每個次級組份用旋轉蒸發(fā)儀除去溶液后進行稱量，再用5%甲醇-水(v∶v)復溶并過0.45 μm 濾膜，制成二維色譜樣品。控制復溶溶液的體積使各個樣品的濃度為500 mg/mL 左右。

第二維制備色譜在半制備型高效液相色譜儀上使用C18MP 色譜柱(10 ×250 mm i.d.，10 μm，100 ?，Agela)。流動相使用水(A)-乙腈(C)體系。流速為4 mL/min。上樣量400 μL。對每個次級組份均采用等度洗脫的洗脫方法，這些洗脫方法分別為:Fr.1(1.1% C 洗脫30 min)，F(xiàn)r.2(1.3% C 洗脫30 min)，F(xiàn)r.3(1.9% C 洗脫30 min)。紫外檢測器檢測波長為214 nm。

分析型色譜在日立高效液相色譜儀上使用C18MP 色譜柱(5 ×250 mm i.d.，10 μm，100 ?，Agela)。流動相使用水(A)-乙腈(C)體系。流速為1 mL/min。上樣量10 μL。對每個化合物均采用等度洗脫的洗脫方法，這些洗脫方法分別為:Fr.1-1(1.1%C 洗脫30 min)，F(xiàn)r.2-1(1.3% C 洗脫30 min)，F(xiàn)r.2-2(1.3% C 洗脫30 min)，F(xiàn)r.2-3(1.3% C 洗脫30 min)，F(xiàn)r.3-1(1.9% C 洗脫30 min)。紫外檢測器檢測波長為214 nm。

Nano-LC-MS/MS 使用C18色譜柱(0.15 × 100 mm i.d.，1.7 μm，300 ?，Column)。流動相使用0.1%甲酸水溶液(D)-0.1%甲酸乙腈溶液(E)體系。流速為200 μL/min，分流后2μL/min。上樣量為20 μL。洗脫方法為:0～15min 5%B，15～60 min 5%B～32%B，60～95min32%～90% B。質(zhì)譜參數(shù)為毛細管電壓3.5KV，離子源溫度250 ℃，掃描范圍100～1800 m/z，肽段碎裂模式為誘導碰撞解離，碰撞能量為35%，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集軟件為Xcalibur version 1.0.0.2;質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件為Proteome Discoverer 1.2，數(shù)據(jù)篩選條件是Xcorr ＞1.9 Charge=1;Xcorr＞2.2 Charge=2;Xcorr ＞3.75 Charge=3;數(shù)據(jù)庫為uniprot 高原鼢鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。

3 結果與討論

3.1 一維制備色譜和固相萃取

塞隆骨水提取物首先在SPE 固相萃取柱上進行預處理。塞隆骨水提取物在SPE 柱上樣后先用5%的甲醇溶液沖去大分子雜質(zhì)，再用10%甲醇溶液洗脫塞隆骨強極性組分。此強極性組分對高分辨率的C18AQ 反向色譜柱來說極性分布依然很廣。因此用多重梯度洗脫的方式對樣品進行洗脫。最后選擇色譜條件為:0～15 min，1% B，15～30 min 1%～10% B;流速為80 mL/min;上樣樣品濃度為30.7 mg/mL;進樣量為4 mL;紫外檢測波長為214 nm。此方法制備時間為30 min，沖洗色譜柱與平衡色譜柱的時間一共30 min，每次進樣一共花費60 min。如圖1 所示，強極性樣品被分成了3 個次級組份。這些次級組份經(jīng)過濃縮干燥后被稱重，組份的質(zhì)量從2 號的0.15 g 到3 號的1.24 g 不等。整個一維色譜制備的回收率為77.3%。

由于本研究的研究對象為大極性小分子多肽，在色譜制備之前首先將樣品用固相萃取柱SPE 進行預處理。固相萃取預處理有如下幾個好處:(1)塞隆骨水提物粗品的成分非常復雜，其中包含的物質(zhì)極性分布非常廣，用固相萃取柱對其中的大極性物質(zhì)進行預富集可以得到更符合本研究要求的大極性混合物;(2)塞隆骨水提物中不乏含有大量的兩性大分子蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在水中溶解度非常好，但是卻會在C18色譜柱上死吸附，造成色譜柱柱效和壽命降低。用SPE 預先除掉這類物質(zhì)可以保護色譜柱;(3)用SPE 固相萃取柱預處理后的樣品在溶解性質(zhì)上極具均一性，可以以非常大的濃度溶解于某一種液態(tài)溶劑中，這樣就可以最大化地避免因樣品體積過大帶來的色譜系統(tǒng)分辨率降低的問題。

圖1 強極性多肽混合物的一維液相制備Fig.1 The first dimensional preparation of strong polar peptides extracts

一維制備色譜實驗在C18AQ 制備色譜柱(50 ×250 mm i.d.，10 μm，120 ?，YMC)上進行。選擇此色譜柱的原因是分離大極性物質(zhì)時在反向色譜柱上只能用少量的強洗脫劑才能保證被分離物具有一定保留因子。而反向色譜柱是一種液-液交互作用色譜柱，在工作時被分離化合物在靠近色譜柱基質(zhì)的液層與流動相之間進行動態(tài)交換。對于水-甲醇流動相體系的普通C18反向色譜分離，一旦甲醇在流動相中的比例小于5%，靠近色譜填料基質(zhì)的液層就會遭到嚴重破壞，色譜體系分離能力嚴重下降。所以用普通C18反向色譜柱分離大極性化合物時，即便將流動相中甲醇濃度降至5%以下，也不一定能夠增加被分離大極性化合物群的峰容量與分辨率。為了解決這個問題，我們選用在色譜填料基質(zhì)的C18基團之間鍵合少量極性基團的極性共聚C18色譜柱。這種新型C18反向色譜柱能在更低的甲醇濃度(小于1%)下穩(wěn)定工作，也能明顯增強強極性化合物的保留因子，非常符合本研究的要求。

3.2 次級組份的二維制備

色譜分離方法的分離能力是衡量色譜系統(tǒng)的主要指標。這個指標最重要的一個評價依據(jù)是分離系統(tǒng)的峰容量。峰容量是指色譜系統(tǒng)第一個峰與最后一個峰之間具備一定分辨率的峰個數(shù)。峰容量與分離材料的種類、分離方法、流動相、被分離物與分離設備等因素息息相關。一維高效液相色譜的峰容量相比傳統(tǒng)柱層析、薄層色譜與排阻色譜有了飛躍性的提高，但是還不能滿足分離如同塞隆骨這樣極復雜天然產(chǎn)物的要求。雖然在一維色譜的基礎上通過改變柱長、柱溫、流動相配比和柱材料可以提高峰容量，但是這種提高非常有限，若想大幅度提高色譜系統(tǒng)的峰容量達到分離復雜天然產(chǎn)物的要求，就必須使用多維色譜。多維色譜峰容量是指所使用所有的單一色譜分離系統(tǒng)的峰容量的乘積。如果一維色譜的峰容量達到500，二維色譜即便使用20 的峰容量，總體系統(tǒng)的峰容量也能提高20 倍，達到10000。這樣就可以輕松對復雜天然產(chǎn)物混合物進行分離了［10-13］。

圖2 次級組分的二維液相制備Fig.2 The second dimensional preparation of the second fractions

由圖1 可知，雖然色譜樣品在SPE 柱上是5%甲醇至10%甲醇中間的一段，其組成依然比較復雜，在色譜圖上只能分辨出三個主要的峰群，這三個峰群中還包含若干單體化合物峰。在一維色譜中雖然已經(jīng)將流動相的甲醇濃度降至1%，整體峰分布在0～30 min 之內(nèi)，依然得不到單體化合物峰。這說明此混合物的組成過于復雜，已經(jīng)遠超一維色譜可以分離的復雜范圍，若要想將此混合物分離成單體化合物，就必須使用二維色譜。Fr.1、Fr.2 和Fr.3 的二維色譜方法首先在相同填料的分析柱上進行摸索，然后放大到制備柱上來由于此時次級組份中的物質(zhì)性質(zhì)已經(jīng)非常相似，用等度洗脫程序就可以達到對其中化合物分離的目的。Fr.1、Fr.2 和Fr.3的二維分離色譜圖見圖2 所示:Fr.1 的組成過于復雜，在二維色譜上僅僅分離出一個主要的單峰，其余物質(zhì)在色譜圖上都是含量接近的低矮碎峰。Fr.2和Fr.3 的二維分離較為成功，均分離成了若干單體化合物。通過對次級組份單體化合物的制備，得到了Fr.1-1(2.2 mg)、Fr.2-1(0.4 mg)、Fr.2-2(0.6 mg)、Fr.2-3(0.5 mg)和Fr.3-1(1.7 mg)五個具備足夠進行結構鑒定所必需質(zhì)量的化合物。

3.3 所分離的小分子肽類化合物的結構鑒定

分離得到的Fr.1-1、Fr.2-1、Fr.2-2、Fr.2-3 和Fr.3-1 五個化合物用基于質(zhì)譜系統(tǒng)的多肽分析方法進行序列鑒定。經(jīng)過Nano-LC-MS/MS 鑒定得到五個化合物的二級質(zhì)譜，利用Thermo proteome Discover 1.2 的SEQUEST 算法與高原鼢鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對，同時結合denovo 測序推斷得到這五個肽段序列如表1 所示。

表1 分離出的小分子多肽序列Table 1 The sequences of the purified peptides

4 結論

本研究建立了一種針對動物組織高極性肽段的分離方法。首先利用SPE 固相萃取柱對粗樣品進行預處理，截取其中的高極性組份作為本研究的研究對象;然后使用親水性的C18AQ 制備柱將SPE 柱后的高極性組份分成了若干次級組份，這些次級組份是一類具備相似結構的簡單混合物;最后利用C18MP 色譜柱將次級組份分離成單體化合物。得益于二維液相色譜的高峰容量和C18AQ 色譜柱與C18MP 色譜柱之間的正交性，分離單體化合物時均得到了高分辨率的色譜圖。此方法適用于所有復雜肽類化合物的分離，不僅僅可以得到高純度單體化合物，還具備很高的制備效率。推廣此方法將會對天然肽類藥物研究起到很好的推動作用。

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