牛糞中纖維素降解菌的分離鑒定及其產酶研究

汪學軍，閔長莉，韓彭磊，張麗君

1皖西學院生物與制藥工程學院;2 皖西學院大別山植物內生菌資源研究中心，六安 237012

近年來，隨著我國畜牧業規模化和集約化的迅速發展，畜禽糞便的產生量也大大增加，已經成為農業固體有機廢棄物的主要生產源。研究發現，畜禽糞便中富含有機質和氮、磷、鉀等元素，可以成為再利用的資源［1］，但是由于畜禽糞便中纖維素與木質素含量高且難以分解利用而被丟棄，從而成為污染源造成環境的污染及資源的浪費［2-4］。因此，如何合理的處理和利用這些畜禽糞便，在不造成環境污染的情況下，又將其轉化為可再生性的資源已成為目前研究的熱點，國內外學者對于微生物能分解轉化纖維素的有關研究相當重視［5，6］。從蚯蚓養殖場泥土中分離篩選出一株纖維素酶高產菌株，研究發現氨化預處理可提高該菌株對玉米秸稈的降解率，經鑒定其屬于枯草芽孢桿菌［7］。楊瑩等從牛糞自然堆肥中分離篩選出2 株降解纖維素能力較強的菌株，初步鑒定其均為曲霉屬真菌，實驗結果表明，這兩株真菌可作為降解畜禽糞便發酵劑的優良生產菌株，且棉粕是較為理想的固體發酵氮源［8］。許玉林等用剛果紅染色法從甘蔗地土壤中分離得到一株具有較強纖維素降解能力的真菌，經鑒定該菌株屬于草酸青霉，其對天然的濾紙降解率較高，在3 d 內對濾紙的降解率為32.95%［9］。高云航等從新鮮牛糞樣品中篩選得到1 株產酶活較高的纖維素分解菌，經鑒定其為短小芽孢桿菌，產酶條件優化結果表明，該菌株以0.5%玉米粉為碳源、1%酵母粉為氮源、初始pH 3.0、42 ℃搖瓶培養54 h 產酶活最高［10］。由此可見，若將這些纖維素分解菌應用于畜禽廢棄物進行無害化處理，可為解決環境污染與資源浪費等問題提供一條可行的途徑。

目前，對于纖維素分解菌選育應用研究較多的是真菌與細菌，尤以曲霉、木霉和青霉為典型，而對放線菌的研究報道較少。本實驗從新鮮牛糞樣品中分離篩選出一株具有較強纖維素分解能力的菌株NF38，通過生理生化特征研究、形態學和16S rDNA生物學手段對其分類鑒定，并對菌株NF38 產酶條件進行了初步研究，以期為纖維素分解菌株的研究奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛糞樣品

六安市億牛乳業荷斯坦奶牛的新鮮糞便。

1.1.2 培養基

液體富集培養基(g/L):選擇羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養基配方，即CMC-Na 10、FeSO4·7H2O 0.001、K2HPO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、NaNO30.5、硫酸鏈霉素0.02;pH 7.2［11］。分離培養基(g/L):CMC-Na 10.0、FeSO4·7H2O 0.001、K2HPO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、NaNO30.5、瓊脂粉15.0;pH 7.2。純化培養基:高氏Ⅰ號固體培養基。種子培養基:高氏Ⅰ號液體培養基。發酵培養基(g/L):CMC-Na 10、酵母浸出粉3.5、MgSO4·7H2O 0.5、輕質CaCO36.0、KH2PO40.1，pH 自然。

1.2 纖維素降解菌株的篩選

新鮮牛糞樣品10 g 加入到裝有90 mL 液體富集培養基的錐形瓶中進行富集培養，30 ℃震蕩培養7 d。取富集后的培養液10 mL 接種至90 mL 液體富集培養基中，再次在同樣的條件下進行富集培養。取后一次的富集培養液1 mL 按10 倍濃度梯度依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5;分別取稀釋10-3、10-4、10-5富集液0.1 mL 至分離培養基平板上涂布均勻后，靜置30 min 后，倒置于30 ℃恒溫恒濕培養箱中培養10 d。采用劃線法對分離平板上的放線菌菌株在純化培養基平板上進行純化至菌落純的放線菌，對純化得到菌株編號和保藏。

取上述純化得到的放線菌菌株分別點種于分離培養基平板中央，30 ℃培養7 d 后，在每個培養平板中倒入0.1%的剛果紅顯色液15 mL，靜置10 min倒去顯色液，并用去離子水漂洗平板表面2～3 次，觀察有無水解圈，并對菌落直徑d 和水解圈直徑D進行測量和記錄。

1.3 菌株NF38 酶活力的測定

菌株NF38 接種到種子培養液中于30 ℃、150 rpm 震蕩培養48 h 后，按5%的接種量轉接于發酵培養基中繼續培養7 d。收獲的發酵液經10000 rpm離心5 min，所得到取上清即為粗酶液，保存備用。

在潔凈的試管中加入1 mL 粗酶液和1.5 mL 的1% CMC-Na 磷酸緩沖液或者濾紙作為底物，在50℃水浴鍋中保溫30 min，然后迅速加入2.5 mL DNS并搖勻，使反應終止，沸水浴5 min，快速冷卻后在波長為540 nm 下測定OD 值，分別測得測定纖維素酶酶活(CMCA)和濾紙酶酶活(FPA)［12］。酶活單位(IU)按國際單位定義為:1 mL 酶液1 min 產生1 mol 還原糖的酶量作為1 個酶活單位［12］。

1.4 菌株NF38 鑒定

1.4.1 菌株NF38 形態學特征和生理生化特征研究

在直徑為90 mm 的培養平板上以劃線法接種菌株NF38，培養后觀察菌落大小、質地、顏色、色素有無等培養特征［13］;而菌絲和孢子絲通過插片法加以培養后在顯微鏡下進行觀察［14，15］。生理生化特征的研究方法參照文獻進行研究并記錄結果［16］。

1.4.2 菌株NF38 的16S rDNA 基因序列測定和系統發育分析

菌株NF38 的DNA 的提取和擴增參照文獻方法進行［17，18］。16S rDNA 序列PCR 擴增采用保守引物27F (5＇-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇)和1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)［19］。對 擴 增 產物進行測序，測序工作委托上海生工生物工程有限公司完成。測定后的序列進行基因登錄號的申請、模式菌株的選取、相似性比較和統統發育樹的構建［20］。

1.5 菌株NF38 產酶條件的研究

1.5.1 發酵溫度對產酶的影響

接種有菌株NF38 的發酵培養基分別于10、20、25、30、35、40、50 ℃條件下進行震蕩培養，搖床轉速為150 rpm，培養7 d，測定CMCA 和FPA 酶活。

1.5.2 發酵初始pH 對產酶的影響

發酵培養基中加入數滴1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH，使其初始的pH 值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0，接種菌株NF38 種子液后置于30 ℃，150 rpm 搖床震蕩培養7 d，測定CMCA和FPA 酶活。

1.5.3 發酵時間對產酶的影響

接種菌株NF38 的發酵培培養基于30 ℃，150 rpm 搖床震蕩培養，分別取3、4、5、6、7、8 d 和9 d 發酵液，測定CMCA 和FPA 酶活。

1.5.4 接種量對產酶的影響

發酵培養基中分別接種1%、5%、10%、15%、20%和30% 菌株NF38 種子液后置于30 ℃，150 rpm 搖床震蕩培養7 d，測定CMCA 和FPA 酶活。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

經過兩次富集培養基的富集培養，淘汰了大部分不能利用CMC-Na 為唯一碳源的微生物，同時，在富集培養基中加入硫酸鏈霉素，又使得大部分細菌不能在其中生長篩選，使得篩選出具有纖維素降解放線菌的概率得到有效的提高。篩選得到放線菌NF38，顯示出良好的纖維素降解能力，其水解圈直徑D 和菌落直徑d 分別為23.6 mm、1.3 mm，D/d值為18.1，測定酶活為32.4 U/mL，放線菌NF38 水解圈如圖(圖1)所示。根據以上的實驗結果，選擇NF38 為研究對象做進一步研究。

2.2 菌株NF38 鑒定

2.2.1 放線菌的形態特征

菌株NF38 在高氏Ⅰ號平板上培養7 d 后，菌落直徑2～3 mm、白色隆起、邊緣整齊光滑(圖2)。氣生菌絲白色、基內菌絲淡黃色;孢子絲為稍微的彎曲狀，螺旋不明顯，球形孢子鏈狀排列在一起，孢子表面光滑、黃色。

圖1 菌株NF38 剛果紅水解圈Fig.1 Hydrolyzed circle of NF38 by Congo-red

圖2 菌株NF38 菌落形態Fig.2 Colony morphology of strain NF38

2.2.2 菌株NF38 培養特征

菌株NF38 除了在營養瓊脂上生長較差外，在其余培養平板上均生長良好，氣生菌絲以乳白色為主，而基內菌絲的顏色多變，不同培養基表現出較大的差異性，在8 種不同培養基上具體培養特征見表1。

表1 菌株NF38 培養特征Table 1 The cultural characteristics of strain NF38

2.2.3 菌株NF38 生理生化特性

菌株NF38 特征中最為典型的是可以很好利用纖維素，革蘭氏染色呈陽性;在10～45 ℃溫度范圍內生長正常，但最適生長溫度為30～40 ℃之間，培養期間沒有黑色素和H2S 的產生;菌株適宜生長pH為4.0～10.0 之間，最適生長pH 為7.4。

菌株NF38 對對碳源利用實驗結果表明可以有效利用實驗項目中多數碳源，顯示出對碳源的利用譜較為廣泛，但是，對肌醇和L-阿拉伯糖不能利用。菌株NF38 生理生化和碳源利用實驗結果(表2)。

表2 菌株NF38 生理生化特征和碳源的利用情況Table 2 The physiological characteristics and carbon utilization of strain NF38

2.2.4 菌株NF38 16S rDNA 序列測定和系統發育樹的構建

菌株NF38 的16S rDNA 擴增產物的長度為1443 bp，通過在Bankit 上在線提交菌株序列擴增方法、菌株來源等相關信息，獲得的基因登錄號為KF790691。菌株NF38 的16S rDNA 序列經Blastn比對結果表明，該菌株與GenBank 中淺紫鏈霉菌(Streptomyces violascens)(EU273550)序列同源性最高。核酸序列比對軟件Clustal X(1.81)進行alignment，利用MEGA 6.02 軟件包中的Kimura-2-Parameter Distance 模型計算進化距離，以Neighbor-Joining法構建系統發育樹(圖3)，1000 次隨機抽樣計算自舉支持率(Bootstrap)，以評估系統發生樹的置信度［21］。由圖3 以看出菌株NF38 在進化樹中與S.violascens(EU273550)親緣關系最近，且處于同一分支上，同源性達到99%。

綜合菌株NF38 形態學特征、碳源利用特征、生理生化特征和16S rDNA 序列的鑒定結果，將牛糞中獲得將具有纖維素降解能力的菌株NF38 鑒定為淺紫鏈霉菌(S.violascens)。

2.3 菌株NF38 產酶條件的研究

2.3.1 發酵溫度對產酶的影響

圖3 菌株NF38 的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NF38

在不同溫度發酵后收獲的粗酶樣品經測活后實驗結果見圖4A，纖維素酶酶活和濾紙酶酶活在30～40 ℃區間內酶的活性相對較高，其中，在35 ℃所產生CMCA 酶的活力最強32.4 U/mL，FPA 酶活為28.7 U/mL;但在40 ℃后急劇下降。這樣的實驗結果可能說明了該菌株長期生活在牛的腸道內，適應了腸道溫度環境，屬于體溫微生物。

2.3.2 發酵初始pH 對產酶的影響

圖4 溫度(A)、pH(B)、發酵時間(C)及接種量(D)對菌株NF38 產酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature (A)，pH value (B)，culture time (C)and inoculation amount (D)on cellulase production of strain NF38

在不同初始pH 值培養條件下收獲的粗酶樣品經測活后實驗結果見圖4B，纖維素酶酶活和濾紙酶酶活在pH 為7.0～8.0 范圍內維持在一個較高水平上，酶活分別達到頂峰，但是pH ＞8.0 以后會出現酶的活性迅速下降的現象，這說明了菌株NF38在中性或者是偏堿性的條件下，最有利于酶的產生和保持較高的活性。

2.3.3 發酵時間對產酶的影響

在不同培養時間下收獲的粗酶樣品經測活后實驗結果見圖4C，菌株NF38 培養3 d 后，纖維素酶酶活和濾紙酶酶活分別僅為6.95、3.46 U/mL，酶的活性在第7 d 時，活性最高，隨后逐漸降低。可能是因為放線菌生長較為緩慢，代謝產物積累是在菌體生長的基礎之上，因此，需要較長的時間來才能達到最高;而之后會出現下降，是因為菌體生長進入衰亡期，一方面菌體衰老死亡，細胞裂解的副產物導致酶的活力下降，另一方面所產生的酶隨著時間延長自身也會發生酶活下降現象。

2.3.4 接種量對產酶的影響

不同接種量經發酵后，所收獲的粗酶樣品經測活后實驗結果見圖4D，接種量在5%～10%范圍內酶活基本保持在同一個較高水平。當接種量＞10%時隨接種量增加酶活相反呈下降趨勢，可能是由于微生物的數量快速增加，發酵培養基中的營養成分被消耗并且已經不能滿足酶的生物合成要求，導致酶還沒有來得及合成或不是其合成最佳條件，因此出現酶活下降的現象。

3 討論

隨著我國集約化養殖業的擴大與人們環保意識的增強，將畜禽糞便進行堆肥化處理，是把這些廢棄物變廢為寶的有效途徑［22］。傳統的堆肥法是利用原料中的土著微生物來降解有機物質，但由于其耗時較長，易產生臭味，且堆肥成品具有肥效較低與養料價值不高等缺點［23］。故人們在發酵過程中往往接種一些功能微生物，以便解決上述問題。將纖維素降解菌添加到畜禽糞便中進行堆肥，使其有機物在功能微生物的作用下礦化與腐殖化，生產出生物有機肥［24，25］。這些生物有機肥施用農田后能起到改良土壤和增加肥效的作用［8］，且能增加農作物的產量，對于自然生態環境的保護，推動生態農業的可持續發展具有非常重要的意義［26，27］。

本研究通過僅含有CMC-Na 為唯一碳源培養基進行篩選，根據透明圈的大小，從新鮮牛糞樣品中篩選到1 株具有較強纖維素降解能力的放線菌菌株NF38，酶活測定結果表明其值為32.4 U/mL，酶活較高，可作為畜禽糞便無害化處理中的潛力菌株。此外，本研究還對菌株NF38 的產酶條件進行了研究，結果表明該菌株在溫度范圍為30～40 ℃區間內酶的活力相對較高(最適溫度35 ℃);pH 范圍為7.0～8.0 時其酶活維持在較高水平上(最適pH 為7.0);接種量在5%～10%區間時其酶活基本保持較高水平(最佳接種量為5%);發酵時間在第7 d時達到產酶高峰。

本研究結合生理生化特征研究、形態學和和16S rDNA 序列分析結果，鑒定菌株NF38 為淺紫鏈霉菌(Streptomyces violascens)。而已有的研究表明從放線菌中篩選到能產生纖維素酶的活性菌株還很少見有文獻報道，目前僅有為數不多文獻報道了放線菌能夠產生纖維素酶的生物活性方面的研究，Waldron 等從土壤中分離得到一株產纖維素酶的放線菌Microbispora bispora，酶活為5.9 U/mL［28］;馮海瑋等等從水稻秸稈垛下土壤分離出一株能降解纖維素JSD-1 放線菌，產酶活性為59.19 U/mL［29］。這與本研究中發現的淺紫鏈霉菌可產纖維素酶的報道有所不同，從而為纖維素降解菌的來源提供了一個新的優良菌種。同時也有報道表明目前淺紫鏈霉菌主要用來提取L-谷氨酸氧化酶，而有關淺紫鏈霉菌產纖維素酶的報道還很鮮見，這也證明了微生物代謝產物的確具有多樣性。

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