烏賊墨黑色素對小鼠臟器系數的影響及排鉛效果的研究

呂 玲，劉 漫，李和生

寧波大學海洋學院食品資源利用研究室，寧波 315211

鉛是自然界廣泛存在的重金屬元素。鉛不僅污染環境，還對我們的身體造成嚴重危害。鉛易通過消化道和呼吸道進入人體，其半衰期長，能蓄積在體內［1］并對人體各個系統均有毒害作用，其中主要病變在神經系統和造血系統。鉛中毒的早期癥狀主要是頭痛、無法集中注意力、反應遲鈍等，中期通常導致貧血和肌肉癱瘓等病癥，嚴重時甚至會導致死亡現象。尤其是對兒童，如果兒童血液中鉛的含量超過0.6 μg/mL 時，就會出現智能發育障礙以及行為異常［2］。

黑色素是一種重要的生物資源，是由絡氨酸氧化而來的不規則多聚物，因結構中存在可與金屬鍵結合的基團(如-COOH、-NH2、-OH)，從而有吸附重金屬離子的特性［3］。目前有一些利用黑色素清除體內重金屬的報道［4，5］。而烏賊作為一種豐富的海洋生物資源，如何將其充分利用是當今的一個熱點問題。烏賊墨是烏賊加工中的廢棄物，它具有許多生物活性，如抗腫瘤活性［6-8］、抗氧化活性［9，10］、抗菌活性［11，12］、免疫活性［13］等。烏賊墨中主要的化學成分是黑素色，劉漫等［14］的研究表明烏賊墨黑色素對重金屬離子Pb2+有吸附作用。本課題以小鼠為研究對象，建立鉛中毒小鼠模型，觀察和分析烏賊墨黑色素對小鼠體內Pb2+的脫除作用，為烏賊墨黑色素作為一種毒性陽離子脫毒劑的開發和利用提供科學依據，同時為提高海洋生物資源的綜合利用率開拓一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料:金烏賊購于寧波市路林市場，-20 ℃冷凍儲藏。實驗動物:ICR 小鼠(24～28 g)，清潔級，由浙江省動物中心提供，合格證號:0008604。主要試劑:醋酸鉛，上?；瘜W試劑總廠;濃硝酸，國藥集團化學試劑有限公司;高氯酸，天津市鑫源化工有限公司。

1.2 主要儀器設備

FD-1D-80 冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司;H-1650 高速臺式離心機，長沙湘儀離心機設備有限公司;AB 104-N 型分析天平，METTLER TOEDO 公司;2100DV 型電感耦合等電子體發射光譜ICP-AES，Perkin Elmer;TENSOR 27 紅外光譜儀，德國Bruker 公司;PB-10 pH 計，德國Sartorius 公司;LDZX-40KB 立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;CS101-1AB 電熱鼓風干燥箱，重慶銀河試驗儀器有限公司;KDN-04 消化爐，上海新嘉電子有限公司;移液槍，德國Eppendorf 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 烏賊墨黑色素的提?。?5］

將冷凍的金烏賊墨囊在4 ℃下解凍，小心去皮去膜，擠出烏賊墨汁并收集于燒杯中。收集完成后加適量超純水浸泡過夜，然后10000 rpm 離心10 min，棄去上清液，沉淀部分繼續加水浸泡，然后再次離心，反復4 次。所得的沉淀用超純水沖洗，然后冷凍干燥，即得烏賊墨黑色素。

1.3.2 烏賊墨黑色素的紅外光譜

稱取100 mg 溴化鉀和1 mg 干燥的烏賊墨黑色素樣品于瑪瑙缽中攪拌混勻，在紅外燈照射下研磨成細粉，用壓片機壓制成片。使用TENSOR 27 紅外光譜儀，掃描500～3500 cm-1波長范圍的光譜吸收值。

1.3.3 動物分組及實驗

1.3.3.1 烏賊墨黑色素毒性實驗

ICR 小白鼠(雄鼠)，體重25 g 左右，隨機分為正常組和烏賊墨處理組，每組10 只。正常組小白鼠用3%苦味酸做標記(1～10 號)，分兩籠飼養:1～5號，6～10 號。烏賊墨處理組同正常組一樣標記分籠飼養。正常組灌胃0.2 mL 超純水，烏賊墨處理組灌胃烏賊墨黑色素(4 g/25 mL，0.2 mL)，每日一次。所有小白鼠每日自由進食標準飼料和飲用去離子水。正常組和烏賊墨處理組中的1～5 號灌胃6 d后停止灌胃，24 h 后稱重并將其處死，采集肝臟和腦進行稱重。剩下的小鼠繼續飼養到12 d 后停止灌胃，24 h 后稱重并將其處死，采集肝臟和腦進行稱重。

1.3.3.2 烏賊墨黑色素對鉛中毒小鼠的解毒實驗

ICR 小白鼠(雄鼠)，體重25 g 左右，隨機分為3組(每組10 只):正常組、鉛模型組、烏賊墨黑色素治療組。三組小鼠均用苦味酸標記(1～10 號)，每組分兩籠飼養(1～5 號和6～10 號)。所有小白鼠每日自由進食標準飼料和飲用去離子水。鉛模型組與烏賊墨黑色素治療組腹腔注射醋酸鉛溶液(40 mg/kg)，正常組注射等量生理鹽水。烏賊墨黑色素治療組1～5 號于染鉛30 min 后灌胃烏賊墨黑色素(4 g/25 mL，0.2 mL)1 次，其余組的1～5 號灌胃等量超純水，24 h 后將每組的1～5 號處死，采集血液、腦和肝保存待測。烏賊墨黑色素治療組的6～10 號則于染鉛24 h 后灌胃烏賊墨黑色素(4 g/25 mL，0.2 mL)1 次，其余組6～10 號灌胃超純水，24 h 后處死各組剩下的小鼠，采集血液、腦以及肝保存待測。

1.3.4 測定指標

1.3.4.1 黑色素對小鼠行為、體質量及臟器系數的影響

解剖時觀察肝臟病變，稱量各組織及體重，計算臟器系數。計算公式如下:

1.3.4.2 小鼠血液、腦、肝中鉛含量的測定

小鼠血液、腦和肝臟用硝酸-高氯酸混合液濕式消化。精確取一定體積(或重量)的待測樣于消化瓶中，按濃硝酸與高氯酸9∶1 的比例加入濃酸，放置過夜，次日將消化瓶置于消化爐上，先進行低溫消解，以免瓶內泡沫過多，當泡沫減少時，則高溫煮沸至溶液呈現棕色，此時加少量硝酸再煮沸到冒白煙，至瓶內溶液呈澄清的無色或淡黃色。將消化液冷卻至室溫，再轉移至10 mL 容量瓶中，以去離子水洗消化瓶數次，合并消化液，加水定容。采用ICP-AES測定消化液中的鉛含量。

1.3.5 數據分析與統計

2 結果與分析

2.1 烏賊墨黑色素紅外光譜

圖1 烏賊墨黑色素的紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of melanin from sepia

用紅外光譜表征烏賊墨的黑色素的功能基團。由圖1 可以看出，烏賊墨黑色素的吸收峰主要是以下三組:3500～3300cm-1、1675～1500 cm-1和1000～1250 cm-1。其中3422.59 cm-1的強吸收峰為O-H 和N-H 伸縮振動;1632.60 cm-1吸收是羧酸基團COO-的振動或芳環C=C 振動或酰胺中C=O 振動;1087.52 cm-1吸收是C-O 伸縮振動。烏賊墨黑色素主要是真黑色素。真黑色素以5，6-二羥基吲哚和5，6-二羥基吲哚酸為前體。吸收峰在3400 cm-1附近表示是C-N 延伸，屬于吲哚或吡咯環，吸收峰在1630 cm-1附近表示歸屬真黑素的吲哚環［16，17］。由圖1 可以判斷烏賊墨黑色素具有吲哚環結構，與李興旺從魷魚墨中精制黑色素的紅外圖譜基本一致［18］。

2.2 烏賊墨黑色素對小鼠臟器系數的影響

從表1 可知灌胃6 d 后正常組小鼠的肝臟和腦的臟器系數與烏賊墨處理組基本一致，由統計學分析得出這兩組臟器系數無顯著差異(P ＞0.05)。處理12 d 后正常組小鼠與烏賊墨處理組的臟器系數也不具有統計學差異。因此，烏賊墨黑色素不會對小鼠肝和腦的生長造成不良影響。

表1 小鼠臟器系數(n=5，/10-2)Table 1 Organ coefficient of mice(n=5，/10-2)

表1 小鼠臟器系數(n=5，/10-2)Table 1 Organ coefficient of mice(n=5，/10-2)

2.3 烏賊墨黑色素對鉛中毒小鼠肝臟、腦及血液的排鉛作用

小鼠染鉛30 min 后灌胃烏賊墨黑色素溶液(4 g/25 mL，0.2 mL)治療，結果見表2。鉛模型組小鼠肝鉛、腦鉛和血鉛含量上升顯著，與正常組相比差異極顯著(P＜0.01)，說明鉛模型建立成功。治療組小鼠肝鉛和血鉛含量與鉛模型組相比分別降低了49.47%和80.59%，差異極顯著(P＜0.01)，而腦鉛含量下降不明顯。

表2 染鉛30min 小鼠組織中的鉛含量(n=5，)Table 2 Lead content in mice tissues after 30 mins of lead poisoning (n=5，)

表2 染鉛30min 小鼠組織中的鉛含量(n=5，)Table 2 Lead content in mice tissues after 30 mins of lead poisoning (n=5，)

注:與正常組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與鉛模型組比較，Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01。Note:Compare with normal，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;Compare with model，Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01.

小鼠染鉛24 h 再灌胃烏賊墨黑色素，治療24 h后將小鼠處死，各組肝臟、腦及血液中的鉛含量見表3。鉛模型組中小鼠肝、腦和血液中的鉛含量與正常組相比，差異極顯著(P＜0.01)，與表2 中鉛模型組相比肝臟、腦及血液中的鉛含量上升了22.8%、100%和365.88%。而染鉛24h 治療組小鼠的肝、腦、血液中鉛的含量與鉛模型組相比分別下降了56.22 %、44.38 %和41.54 %，其中肝臟和血液中鉛含量差異極顯著(P＜0.01)，腦鉛含量差異顯著(P＜0.05)。

由表2、表3 的結果可得出烏賊墨黑色素能夠促進染鉛24 h 以內小鼠肝臟及血液排鉛。

表3 染鉛24h 小鼠組織中的鉛含量(n=5，)Table 3 Lead content in mice tissues after 24 h of lead poisoning(n=5，)

表3 染鉛24h 小鼠組織中的鉛含量(n=5，)Table 3 Lead content in mice tissues after 24 h of lead poisoning(n=5，)

注:與正常組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與鉛模型組比較，Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01。Note:Compare with normal，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;Compare with model，Δ P＜0.05，ΔΔ P＜0.01.

2.4 鉛中毒模型分析

鉛中毒的模型有多種，有學者采用給大鼠飲用醋酸鉛水來建模，也有學者采用給大鼠喂鉛飼料的方法，本實驗模型是參閱北京醫科大學中德聯合實驗室的方法［19］，采用腹腔注射醋酸鉛溶液，建立的小鼠鉛中毒模型。由表2 和表3 知鉛模型組的腦、肝和血液中鉛的含量均與正常組有顯著性差異，表明建模成功。

2.5 烏賊墨黑色素對鉛中毒小鼠解毒作用分析

由烏賊墨黑色素對鉛中毒小鼠的解毒實驗可知，小鼠腹腔注入高劑量的鉛離子后(染鉛30 min)血液與肝臟中的鉛含量上升顯著，染鉛24 h 后血液與肝臟中的鉛含量比染鉛30 min 時上升了365.88%與22.80 %。由此可以看出血液中鉛含量隨著時間變化明顯，是鉛中毒較為明顯的一個參考指標。染鉛30 min 與24 h 后進行烏賊墨黑色素灌胃治療，黑色素中的-COOH、-NH2、-OH 基團與鉛離子絡合，與染鉛組比較，小鼠的肝臟和血液鉛含量下降顯著。表明烏賊墨黑色素對24 h 以內鉛中毒小鼠有明顯的促排鉛作用。而長時間鉛中毒，臟器與血液中的鉛離子均有一定的蓄積，烏賊墨黑色素是否有顯著的治療效果，有待進一步研究。

3 結論

本文初步研究了烏賊墨黑色素作為解毒劑對鉛中毒小鼠體內鉛的清除效果。研究結果表明烏賊墨黑色素對小鼠的肝臟和腦生長無不良影響，是一種安全、天然的產物;鉛中毒小鼠于染毒30 min 或24 h 灌胃烏賊墨黑色素后，肝臟和血液中鉛的清除效果顯著(P＜0.01)。本文的研究結果可為開發治療鉛中毒的天然藥物提供一些科學依據。

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