肝素/殼聚糖微膠囊的制備及其抗凝血性能

梁 艷， 宋家鴻， 陳荊曉， 陳敬華

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

肝素/殼聚糖微膠囊的制備及其抗凝血性能

梁 艷， 宋家鴻， 陳荊曉， 陳敬華*

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

采用層層自組裝（LbL）技術制備了肝素/殼聚糖（HEP/CHI）5微膠囊，并研究了其抗凝血性能、胃腸道穩定性和毒副作用等。結果表明：該微膠囊具有球形結構；在pH 5.0、7.4中肝素能夠緩慢可控地釋放；在pH 5.0、7.4以及模擬胃液、腸液條件下具有穩定性；APTT法和全凝固實驗驗證了它在體外具有良好的抗凝血效果；并且對內皮細胞無細胞毒性。因此，該微膠囊有望作為口服劑型，用于臨床肝素給藥。

微膠囊；肝素；抗凝血；層層自組裝；口服劑型

肝素（Heparin，HEP）是一種臨床上廣泛使用的抗凝血藥物，一般采用靜脈或皮下注射方式給藥[1-2]。這一給藥方式對于有血凝塊危險的病人而言，具有可能引發感染、病患適應度低和成本高昂等問題[1]?？诜嗡厥墙暄芯康臒狳c，但肝素在胃腸道中存在易被降解失活[3-4]，難以透過黏膜吸收[5]等問題。層層自組裝（LbL）微膠囊是一種新型的多功能載體，其具有改善藥物穩定性、控制藥物釋放以及可功能化修飾等優點[6-7]。利用具有不同理化性質的生物活性材料制備微膠囊，可有效改善藥物的穩定性[6]和生物利用度[8]。殼聚糖（Chitosan，CHI）是一種天然的陽離子聚合物，具有良好的生物相容性、低毒性、生物可降解性、強生物粘附能力以及促進藥物跨上皮黏膜傳遞等優點[8-10]。將它作為載體，可以促進藥物在胃腸道的滲透吸收[9，11]。本文作者通過LbL法制備（HEP/CHI）5微膠囊，并對其抗凝血性能、胃腸道穩定性和毒副作用等性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑與儀器

肝素鈉（分子量15 kDa），購于生物工程（上海）有限公司；殼聚糖鹽酸鹽（分子量50 kDa，脫乙酰度91%），購自浙江澳興生物科技有限公司；活化部分凝血活酶時間（APTT）測定試劑盒（鞣花酸），購自上海太陽生物技術有限公司；人血漿，由無錫市第四人民醫院提供；兔血，取自成年新西蘭兔。

S-4800型掃描電子顯微鏡 （SEM），H-7650型透射電子顯微鏡（TEM），日本日立有限公司制造；C1-si激光共聚焦電子顯微鏡（CLSM），日本尼康映像儀器有限公司制造；Zetasizer Nano ZS納米粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司制造；DMIL LED倒置熒光顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司制造；Fluoroskan Ascent FL熒光和化學發光檢測儀，Multiskan GO通用微型孔板分光光度計，賽默飛世爾科技有限公司制造。

1.2 （HEP/CHI）5微膠囊的制備

將CHI 1 mg溶于0.33 mol/L K2CO3溶液5 mL中，將等量CaCl2快速加入其中，制備CaCO3球形模板（Template）[12]。利用層層自組裝（LbL）技術[13]制備（HEP/CHI）5-Template微膠囊。將CaCO3微球150 mg浸沒到2 g/L肝素溶液1 mL中，37℃孵育15 min至靜電吸附達到平衡，用去離子水小心洗凈微球，之后再浸沒到2 g/L殼聚糖溶液1 mL中，繼續37℃下孵育15 min。重復上述操作，至（HEP/CHI）5微膠囊制備完成。加入0.4 mol/mL pH 7.4乙二胺四乙酸二鈉 （EDTA）溶液4 mL，除去CaCO3模塊，得到（HEP/CHI）5微膠囊。為進行熒光觀測，用異硫氰酸熒光素（FITC）對HEP進行標記。

1.3 LbL自組裝條件優化

首先對微球加入聚電解質溶液中的吸附時間進行優化。操作步驟如1.2中所述，孵育時間為15 min或2 h。每吸附一次聚電解質，取樣用去離子水洗凈后再分散于水中，此時微球渾濁液pH為9.4，測定微球表面的ζ-電勢。隨后對LbL自組裝過程中聚電解質的濃度進行優化。將CaCO3微球150 mg，分別加入不同濃度的等體積肝素或者殼聚糖溶液中，37℃孵育15 min，收集沉淀，再分散到pH 7.4或pH 9.4的緩沖液中，分別測量微球表面的ζ-電勢。檢測殼聚糖濃度影響時，CaCO3微球將先吸附一層肝素后，再吸附不同濃度的殼聚糖。誤差棒由3組平行樣品計算標準偏差所得。

1.4 LbL自組裝過程中微球表面ζ-電勢和粒徑的變化趨勢

將CaCO3微球150 mg使用層層自組裝技術（LbL）裝配微膠囊壁，操作過程如1.2所述。將微球再分散到pH 7.4緩沖液后，使用Nano ZS納米粒度儀測量ζ-電勢和粒徑。誤差棒由3組平行樣品計算標準偏差所得。

1.5 CaCO3微球與（HEP/CHI）5微膠囊形貌觀察

將少量CaCO3微球滴至鋁箔片上，干燥后噴金處理，用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察CaCO3微球的形貌。將（HEP/CHI）5微膠囊用0.2 g/mL磷鎢酸鈉溶液染色，使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察其干態下形貌。將（HEP/CHI）5微膠囊用激光共聚焦電子顯微鏡 （CLSM）觀察其在水溶液中的形貌，微膠囊中HEP用FITC標記。

1.6 抗凝血活性分析

將0.1、0.5、2 g/L（HEP/CHI）5微膠囊、0.25 g/L肝素、生理鹽水各1 mL，分別加入兔血2 mL中，于0 h和1 h后拍攝照片。肝素作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照。

利用APTT法檢測 （HEP/CHI）5微膠囊的抗凝血時間。將0.445 g/L（HEP/CHI）5微膠囊于37℃中孵育，待HEP釋放1 h或24 h后，分別取樣品15 μL和人血漿100 μL混合，按照活化部分凝血活酶時間（APTT）測定試劑盒說明書操作，記錄凝血時間。生理鹽水作為對照組。

隨后檢測微膠囊質量濃度對凝血時間的影響。將梯度質量濃度（HEP/CHI）5微膠囊置于37℃中孵育，待HEP釋放24 h后，APTT法檢測溶液的抗凝血時間，肝素作為對照組。

1.7細胞毒性試驗

將內皮細胞（ECs）在DMEM培養基中培養，培養基加入了質量分數10%胎牛血清FBS和質量分數1%雙抗（青霉素與鏈霉素，10 000 U/mL），37℃，質量分數5%CO2濕潤環境培養。MTT法測試（HEP/CHI）5微膠囊對ECs的細胞毒性。將細胞用胰酶消化后加入96孔細胞板中，每孔8 000個細胞。每孔加入含質量分數10%小牛血清的DMEM培養基100 μL，培養24 h，棄去培養基。再加入梯度質量濃度的（HEP/CHI）5微膠囊100 μL，培養24 h后，PBS沖洗，每孔加入MTT（0.5 mg/mL，PBS）110 μL，繼續培養4 h。棄去孔中液體，加入二甲亞砜100 μL，充分溶解生成的甲瓚，使用通用微型孔板分光光度計測量570 nm處的UV吸收OD值，通過公式（1）計算細胞存活率。肝素作為對照組。

式（1）中：ODyp為加入藥物時的UV吸收值，ODdz為不加藥物時的UV吸收值，RC為細胞存活率。

1.8 穩定性分析

利用肝素的釋放行為檢測 （HEP/CHI）5微膠囊在pH 5.0或7.4條件下的穩定性。將（HEP/CHI）5微膠囊約75 mg分散于1 mL水中，兩等分，分別加入透析袋（MWCO 25 kDa）中，之后將透析袋置于pH 5.0或7.4 PBS溶液6 mL中進行透析。間隔一定時間取樣，樣品在激發波長480 nm、發射波長520 nm處測定FITC的熒光強度，并由公式（2）計算HEP的累積釋放率。每個實驗都進行3組平行實驗，取平均值。

式（2）中：Mt為t時刻HEP的累積釋放量，Mo為微膠囊中HEP總量，RS為HEP累計釋放率。

為了測量 （HEP/CHI）5微膠囊中HEP的總量，將微膠囊12.5 mg加入6 mol/L HCl溶液1 mL中，測量FITC熒光強度，通過標準曲線計算HEP總量，激發波長為485 nm，發射波長為520 nm。

隨后檢測（HEP/CHI）5微膠囊在模擬胃液、腸液條件下的穩定性。將（HEP/CHI）5微膠囊25 mg分別加入到模擬胃液1 mL（胃蛋白酶活力>1 200 U/mL，pH 2）或模擬腸液1 mL（胰酶，pH 6.8）中，于37℃孵育，間隔一定時間取樣，樣品置于沸水中3 min使酶失活后，使用倒置熒光顯微鏡拍攝圖像。PBS作為對照組。

2 結果與討論

2.1 LbL自組裝條件優化

2.1.1 聚電解質沉積時間選擇在LbL自組裝過程中，微球吸附聚電解質的時間長短，可能影響聚電解質吸附到微球表面的量。如圖1（a）所示，不同的吸附時間15 min和2 h導致的ζ-電勢變化差異并不明顯，這說明15 min的時間長度已經足夠聚電解質在微球表面吸附達到平衡狀態，延長時間并不能使更多的聚電解質沉積到微球表面。相反，2 h反而會使實驗誤差增大，穩定性下降。因此15 min更適合作為聚電解質的沉積時間。

2.1.2 聚電解質濃度對微膠囊制備的影響已有研究文獻[14]報道，聚電解質濃度的強弱也是影響LbL自組裝的因素之一，因此對其進行優化。從圖1（b）可知，隨著殼聚糖質量濃度的增大，微球表面ζ-電勢呈現明顯上升趨勢，質量濃度低于0.5 g/L時上升趨勢迅猛，2 g/L后才逐漸平穩。這一方面表明低質量濃度殼聚糖不足以使微球表面靜電吸附達到平衡。另一方面質量濃度過大（>3 g/L）時，殼聚糖溶液黏度將大幅上升，降低它的分子擴散速度，影響自組裝效率。因此，2 g/L殼聚糖最為適合。另外，由圖1（c）可知，隨著肝素質量濃度的增大微球表面ζ-電勢呈現明顯下降趨勢，低質量濃度時ζ-電勢迅速下降，2 g/L后ζ-電勢幾乎不再變化。但隨著肝素質量濃度繼續升高，誤差有所增大。所以選取2 g/L肝素為宜。

另外，在圖1（a）中所有ζ-電勢值均處于負值，這并不符合微膠囊LbL組裝的原理。這種現象可能是由于測量時微球懸液的pH值所致。因此隨后檢測了pH 9.4（CaCO3微球渾濁液pH）和pH 7.4（血液pH）條件對ζ-電勢的影響。如圖1（b）（c）所示，pH 7.4時ζ-電勢數值范圍與pH 9.4時幾乎均相差20 mV左右，但隨質量濃度變化的趨勢基本相同。這表明圖1（a）中ζ-電勢均為負值的現象主要是由于檢測時pH為9.4所導致，而非為微膠囊制備工藝本身的原因。將檢測時pH調節為7.4后，如圖1（d）所示，ζ-電勢將隨聚電解質膜層數的增加，呈現明顯的正負值交替現象。這表明帶有相反電荷的肝素和殼聚糖交替吸附到CaCO3模板的表面，完成了LbL自組裝的過程。

圖1 LbL自組裝過程Fig.1 During LbL self-assembly （a） impactof polyelectrolyte coating time， impact of（b）heparin or（c）chitosan ionic strength，（d）ζ-potential and size of each layers

2.2 CaCO3微球與（HEP/CHI）5微膠囊形貌觀察

隨后對微膠囊形貌特征和粒徑變化進行了觀察。從形貌上看，SEM圖2（a）中CaCO3內核具有適于微膠囊制備的球霰石晶體微球形態[15-16]，結構致密。TEM圖2（b）顯示（HEP/CHI）5微膠囊為多孔松散的膜結構，表明這種微膠囊可能具有較強滲透性。CLSM圖2（c）中還可觀察到這種藥物載體是內有空腔的圓形膠囊結構。

從粒徑變化來說，圖1（d）顯示在LbL自組裝過程中微球的尺寸基本都保持在4 μm左右，沒有隨膠囊壁的組裝而大幅增加。由CaCO3球SEM圖2（a）可知，CaCO3微球模板尺寸大約在3.9 μm左右，兩者差別較小，可推斷微膠囊尺寸大小主要由模板的尺寸決定。另外TEM圖2（b）中微膠囊的粒徑大約在4.2 μm，CLSM圖2（c）中粒徑卻大約為5.2 μm。這種尺寸變化可能是由于CaCO3模板去除后微膠囊內腔中無機離子濃度增加使滲透壓增加，從而使微膠囊發生膨脹的緣故，表現在CLSM圖2（c）中微膠囊尺寸偏大。拍攝TEM圖像時微膠囊脫水又導致它收縮并塌陷，微膠囊尺寸縮小。

圖2 FITC熒光標記微膠囊中HEPFig.2 （a）SEM observation of CaCO3template，（b）TEM and（c）CLSM images of（HEP/CHI）5microcapsule labelled by FITC

2.3微膠囊的抗凝血活性和毒副作用

如圖3（a）（b）所示，0 h時所有試管中血液均為未凝固狀態，但1 h后生理鹽水和0.1、0.5 g/L微膠囊試管中血液已經凝固，肝素和2 g/L微膠囊試管中血液沒有凝固，這說明（HEP/CHI）5微膠囊具有抗凝血功效，能夠延長凝血時間。

為了進一步研究 （HEP/CHI）5微膠囊的抗凝血效果，使用APTT法測試了不同釋放時間后微膠囊懸液的抗凝血時間。對比于對照組生理鹽水（37±1）s的凝血時間，不同時間后的微膠囊懸液都能延長血漿的凝血時間，1 h后微膠囊懸液的抗凝血時間延長（11±3）s，而24 h后的抗凝血時間則為（90±6）s左右。這表明微膠囊的抗凝血功效依賴于肝素的釋放。此外，如圖3（c）所示，隨著微膠囊質量濃度的增大，抗凝血時間也逐漸延長，并且微膠囊的質量濃度與抗凝血效果呈正相關。

另外，由圖3（d）內皮細胞ECs的MTT細胞毒性結果可知，（HEP/CHI）5微膠囊對ECs細胞幾乎沒有毒性，說明這種微膠囊毒副作用極小。

2.4 微膠囊穩定性

為了研究 （HEP/CHI）5微膠囊在胃腸道中的穩定性，利用肝素在pH 5.0和7.4條件下的體外釋放行為，檢測微膠囊在十二指腸（pH 4.2～8.2）和腸道（pH 7.4）環境的穩定性。微膠囊中肝素載藥率為（37.5±0.3）%。如圖3（e）所示，兩種pH下肝素都以極緩慢的速率釋放，到24 h后HEP的釋放量還不足微膠囊中肝素總量的30%。這說明該微膠囊在pH 5.0和7.4條件下是穩定的。

圖3 血液中加入微膠囊Fig.3 Blood coagulation state after（a）0 h and（b）1 h，（c）Impact of microcapsule concentration on anticoagulanteffect，（d）ECs cellcytotoxicity assay，（e）Heparin release behavior

此外，還進一步檢驗了（HEP/CHI）5微膠囊在模擬胃液或模擬腸液中的穩定性，如圖4所示。在經過4 h模擬胃液或模擬腸液處理后，微膠囊依然保持良好的圓環形狀，絕大部分微膠囊都未被降解。由此可以推斷，該微膠囊對胃腸道環境應當具有穩定性，有望作為口服劑型用于肝素給藥。

3 結語

在口服藥物的研究中，藥物胃腸道的吸收通常有4個主要影響因素——藥物的溶解性、穩定性、膜通透性和首過效應[17]。一方面，藥物的溶解性和穩定性可以通過藥物傳遞技術進行調節；另一方面，表面活性劑等吸收促進劑可以改善藥物的跨胃腸道黏膜轉運，提高藥物的生物利用度[17]。

圖4 （HEP/CHI）5微膠囊的FITC熒光標記圖像（標尺為10 μm）Fig.4 Fluorescence images of FITC labelled（HEP/CHI）5microcapsules incubating in（a）PBS，（b）simulated gastric fluid or（c）simulated intestinal fluid（The scale bar was 10 μm）

本文作者設計的微膠囊可以在胃腸道中為HEP隔離周遭不利環境，提高了HEP的穩定性。另已有文獻報道，CHI是一種具有良好生物相容性的黏膜傳遞吸收促進劑[10]，可以促使緊密連接的結構蛋白質（ZO-1、閉合蛋白質）和細胞骨架蛋白質（F-肌動蛋白質）等重新分布，改變上皮細胞的緊密連接和細胞骨架，使藥物能夠跨上皮黏膜傳遞[8]。CHI的促進作用有可能增強HEP在胃腸道中的滲透吸收。此外，在微膠囊的LbL制備工藝中，常規載藥方式制得的微膠囊往往在最初幾個小時將大部分HEP釋放。但在人機體內低質量濃度HEP就已經具備預防血栓形成的功效[18]。Frank Caruso等人[19]提出的膜間載藥新方式，將更適合微膠囊中HEP緩慢釋放的需求。

根據上述思路制備的（HEP/CHI）5微膠囊，不僅有可能促進肝素的胃腸道吸收，有效地減緩HEP釋放速率，并延長它在血液中的循環時間，還具有促進HEP口服吸收的潛力，有望作為口服劑型用于肝素給藥，具有很大的市場前景。

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Preparation of Heparin/Chitosan Microcapsule for Anticoagulation Study

LIANG Yan， SONG Jiahong， CHEN Jingxiao， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Heparin/chitosan（HEP/CHI）5microcapsules for anticoagulation were prepared by Layerby-layer（LbL）technique.The stability of（HEP/CHI）5microcapsules under pH 5.0 and 7.4，simulated gastric and intestinal juices conditions was studied respectively，APTT anticoagulant time and cytotoxicity of microcapsules against endothelial cells were estimated.Results indicated that（HEP/CHI）5microcapsuleswere ofsphericalstructure and stable in differentsimulated physiological milieus；they could behave favorable anticoagulant efficacy with no significant cytotoxicity.Thus，（HEP/CHI）5microcapsules were promising for clinical heparin administration as a novel oral dosage form.

microcapsule，heparin，anticoagulation，LBL，oral dosage form

R 944.9

A

1673—1689（2015）03—0295—07

2014-04-11

教育部博士點基金項目（20110093110008）；江蘇省自然科學基金項目（BK2012557）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物大分子和生物功能材料的研究。

E-mail：jhchenwhut@126.com