γ-氨基丁酸改善高脂膳食小鼠的骨性能

田英杰， 孫 進，2， 謝振興， 馬玉華， 樂國偉，2， 施用暉*，2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

γ-氨基丁酸改善高脂膳食小鼠的骨性能

田英杰1， 孫 進1，2， 謝振興1， 馬玉華1， 樂國偉1，2， 施用暉*1，2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

探討了高脂膳食小鼠補充γ-氨基丁酸（GABA）對骨性能的影響。40只6周齡C57BL/6雄性小鼠，隨機分成4組：正常日糧組（control），高脂日糧組（HFD），高脂日糧小鼠飲水補充0.06、0.12 g/dL GABA組。試驗結束前一周收集各組小鼠尿液，測定鈣及羥脯氨酸含量；第20周結束試驗，測定小鼠股骨、脛骨參數，以及股骨氧化還原指標，熒光定量PCR檢測相關基因表達。結果顯示，與對照組相比，HFD組股骨出現氧化應激，股骨GAD65顯著下調、GABAbR顯著上調（P＜0.05），GSK3β顯著上調而Nrf2顯著下調（P＜0.05）；股骨和脛骨鈣含量、骨強度等相關性能指標顯著降低，尿鈣及羥脯氨酸含量顯著增高，且成骨細胞分化標志基因BGLAP2、col1a1顯著下調，破骨細胞分化標志基因RANKL/OPG、CTSK、TRAP顯著上調 （P＜0.05）。補充0.06、0.12 g/dL GABA可恢復GABAbR、GSK3β、Nrf2表達（P＜0.05），減輕股骨氧化損傷，同時平衡骨細胞分化及代謝，提高股骨和脛骨性能。結果表明，GABA可調節股骨氧化還原狀態，平衡骨代謝，改善股骨及脛骨性能；0.12 g/dL GABA改善股骨氧化應激和股骨性能的作用優于0.06 g/dL的。

γ-氨基丁酸；骨性能；高脂日糧；氧化應激；小鼠

長期高脂膳食飼喂小鼠，伴隨著肥胖發生，小鼠股骨出現氧化應激并誘發骨代謝失衡，股骨礦物質含量及骨強度顯著下降[1-2]。γ-氨基丁酸 （γaminobutyric acid，GABA）是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，給高脂膳食小鼠補充GABA可抑制肥胖的發生和發展，調節異常血糖[3]，減輕體內氧化應激[4]；且用一定劑量GABA飼喂去卵巢大鼠可顯著提高成骨細胞分化相關基因表達[5]。但GABA是否對高脂膳食下氧化應激介導的異常骨代謝及骨性能具有調節作用尚不清楚。GSK3β是抗氧化核轉錄因子Nrf2的負調節蛋白質[6-7]，而GABA-B型受體（GABAbR）參與抑制GSK3β活性[8]，可能間接利于Nrf2入核發揮抗氧化作用。體外試驗證實，成骨細胞可表達GABAbR[9]，然而GABA是否在骨組織中通過該受體激活Nrf2抗氧化系統尚未見研究報道。本課題旨在研究GABA能否通過減輕氧化應激改善骨代謝、提高骨性能，并探討GABA發揮抗氧化作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

GABA，純度99%，sigma公司產品；Trizol裂解液，美國Biomiga公司產品；M-MLV逆轉錄酶，5×逆轉錄緩沖液，RNAse Inhibitor，dNTPs，TaqDNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司產品；DEPC，Generay Biotech公司產品；熒光染料SBY，Bioneer公司產品；基因引物，上海捷瑞生物工程有限公司合成；還原性谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSSG）標準品，購于中國醫藥集團化學試劑有限公司；丙二醛（MDA），總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，購自南京建成生物公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 試驗動物及樣本制備

40只6周齡清潔級C57BL/6雄性小鼠，合格證號SCXK（滬）2007-0005，上海斯萊克動物有限責任公司提供，初始體質量18～20 g。正常日糧預飼1周后隨機分為4組：正常日糧組（control）；高脂日糧組（HFD），給予純水飲用；高脂日糧小鼠飲水補充0.06、0.12 g/dL GABA組，同文獻[4]。正常飼料和高脂飼料配方見表1。小鼠同室分籠飼養，自由采食飲水，室內溫度（23±2）℃、濕度60%，給予12 h/12 h白天-夜晚循環光照。

試驗第19周，連續3天收集小鼠尿液，用于測定鈣和羥脯氨酸含量；于試驗第20周，將各組小鼠禁食12 h，乙醚麻醉后處死小鼠，迅速取小鼠股骨、脛骨去除附著組織，取左腿股骨頭置于Trizol中用于總RNA提取，剩余部分勻漿后擬測定氧化還原指標；同時取右腿股骨、脛骨保存于-80℃，用于股骨、脛骨性能指標測定。所有試驗操作均按照江南大學實驗動物管理和使用委員會的指導規則進行。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 股骨、脛骨性能參數測定骨長度（femoral length，cm）：用游標卡尺測定股骨、脛骨長度；骨強度（femoral strength，N）：將股骨、脛骨分別置于質構儀上（Stable Micro System，英國），固定兩端股骨頭，加載速度2 mm/s，股骨斷裂以后，計算機界面上顯示載荷變形曲線，獲得最大載荷值；股骨、脛骨干質量（g）：105℃烘干至恒質量；灰分（BMC，mg）：將樣品置于馬弗爐 （SX-4-10型箱式電阻爐控制箱，天津市泰斯特儀器有限公司制）500℃灰化至恒質量，測定灰分質量；鈣質量分數（femoral Ca content，mg/ g）：灰分加入濃鹽酸，煮沸10 min，定容至10 mL，采用EDTA滴定法測定鈣質量分數，結果以mg/g計量；計算骨骼指數：骨骼指數（mg/mm）=骨干質量/骨長度，能夠反映骨密度。

表1 飼料配方Table 1 Composition of diets

1.3.2 尿液鈣及羥脯氨酸含量測定尿液中鈣、羥脯 氨 酸 （hydroxyproline，HOP） 含 量 和 肌 酐（creatinine，Cr）含量檢測，嚴格按照南京建成試劑盒說明書操作。

1.3.3 股骨氧化還原狀態測定MDA（nmol/mg）采用硫代巴比妥酸法測定，SOD活力 （U/mg）采用黃嘌呤氧化酶法測定，T-AOC（U/mg）采用菲啉類絡合物比色法測定，以上測定均嚴格按照南京建成試劑盒說明書操作；組織蛋白質采用考馬斯亮藍法測定，GSH和GSSG含量采用熒光比色法（SpectraMax M5/M5e酶標儀，Molecular Devices公司制）測定。

1.3.4 實時熒光相對定量PCR分析提取股骨頭的總RNA，測定260 nm/280 nm吸光度比值1.8～2.0（one-drop spectrophotometer，上海采邑生物科技有限公司提供），逆轉錄合成cDNA；以β-actin為內參，對目的基因進行PCR擴增（7900HT Fast Realtime PCR儀，美國應用系統公司制），檢測模板Ct值進行相對定量，引物序列見表2。股骨頭總RNA提取方法參照文獻[10]并根據試驗條件改進。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Sequences of primers in quantitative real-time PCR

1.4數據處理

數據整理后采用SPSS統計軟件中one-way ANOVA進行差異顯著性檢驗分析。試驗數據以平均數±標準差表示，顯著性水平為P<0.05。采用Pearson相關系數分析兩變量之間的相關性，得到相關系數及顯著性。

2 結果

2.1 GABA對高脂膳食小鼠股骨、脛骨性能的影響

由表3可知，飲食干預20周，HFD組體質量顯著高于對照組，而0.06、0.12 g/dL GABA組體質量顯著降低（P＜0.05）；與對照組相比，HFD組股骨長度、干質量、灰分、鈣含量、骨骼指數以及骨強度均顯著下降（P＜0.05）；脛骨長度、灰分、鈣含量、骨強度均顯著低于正常膳食小鼠，提示HFD組伴隨著肥胖發生，股骨及脛骨性能下降。相對HFD組，0.06 g/dL GABA組股骨長度顯著增長 （P＜0.05），干質量、灰分、鈣含量、骨骼指數、骨強度分別增加4.60%、12.84%、4.29%、5.92%、9.71%（P＞0.05），同時脛骨長度、鈣含量、骨強度顯著提高（P＜0.05），灰分增加10.20%（P＞0.05）；而0.12 g/dL GABA組股骨干質量、灰分、骨骼指數分別提高4.82%、12.17%、8.71%（P＞0.05），股骨長度、鈣含量、骨強度顯著提高（P＜0.05），同時脛骨鈣含量顯著增加、骨強度顯著增強（P＜0.05），脛骨灰分增加10.29%（P＞0.05），表明飲水補充GABA在抑制高脂膳食小鼠肥胖發生的過程中，可提高股骨及脛骨性能。其中，0.12 g/dL GABA組對體質量和股骨性能干預作用優于0.06 g/dL組的。

表3 各組小鼠股骨、脛骨參數（±s）Table 3 Femur and tibia parameters of mice in different groups（±s）

表3 各組小鼠股骨、脛骨參數（±s）Table 3 Femur and tibia parameters of mice in different groups（±s）

注：表內數值上標相同字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同字母表示差異顯著（P＜0.05），下表同。

測定項目 對照組HFD組HFD+GABA組0.06 g/dL體質量/g 0.12 g/dL27.03±0.92a33.23±3.63c30.52±1.81b28.97±1.74b股骨股骨長度/mm15.85±0.30a16.44±0.17b干質量/mg52.88±1.14b48.87±5.19ab股骨鈣/(mg/g)140.42±9.09b127.79±4.83a48.97±4.73ab133.27±8.39ab139.19±8.21b16.32±0.34b29.91±2.93aBMC/mg34.68±0.91b46.72±3.95a33.55±3.64ab股骨指數/（mg/mm）2.87±0.22a3.20±0.06b33.75±4.05ab3.12±0.26ab3.04±0.26ab股骨強度/N21.02±1.15b17.72±1.15a16.19±0.25b19.44±1.54ab20.55±1.42b脛骨股骨長度/mm17.93±0.11a18.25±0.30c18.09±0.14bc18.00±0.09ab干質量/mg39.82±2.22 39.07±3.54125.88±17.56a36.38±2.51153.54±13.01b151.65±23.11b146.22±19.29b股骨鈣/(mg/g)26.12±0.99bBMC/mg 23.14±1.85a25.50±2.76ab25.52±2.75ab股骨指數/（mg/mm）2.20±0.092.07±0.152.17±0.19股骨強度/N 2.11±0.2014.44±0.77b38.12±3.8312.90±0.94a14.62±1.08b14.46±1.12b

2.2 GABA對高脂膳食小鼠尿液鈣、羥脯氨酸含量的影響

骨轉換時產生的生物代謝標志物能夠用來預測骨量丟失的速率并評估骨折風險[11]，其中羥脯氨酸是膠原蛋白質特有降解產物，尿液中鈣含量也與絕經后婦女的骨密度呈顯著負相關[12]。圖1表明，HFD小鼠尿液中羥脯氨酸和鈣含量顯著高于正常膳食小鼠，反映肥胖小鼠體內較強的骨分解活動。相較于HFD組，0.06 g/dL、0.12 g/dL GABA組的尿鈣、羥脯氨酸含量降低至與對照組無顯著差異（P＞0.05），反映出一定劑量GABA可抑制高脂膳食下異常活躍的骨基質分解活動。

圖1 各組小鼠尿液中羥脯氨酸和鈣含量Fig.1 Urinary HOP and calcium content in different groups

2.3 GABA對高脂膳食小鼠骨細胞分化的影響

圖2表明，HFD組股骨RANKL/OPG、CTSK、TRAP比對照組顯著上調（P＜0.05），Col1a1、BGLAP2表達顯著下降（P＜0.05），反映出HFD小鼠體內成骨細胞分化受抑制、破骨細胞分化作用增強。飲水補充 0.06 g/dL、0.12 g/dL GABA組 RANKL/OPG、CTSK、TRAP顯著下調（P＜0.05），Col1a1、BGLAP2表達上升且與對照組無顯著差異。由此推斷，GABA可通過在分子水平調控成骨細胞和破骨細胞相關基因表達，維持骨代謝平衡。

圖2 成骨細胞和破骨細胞分化標志基因表達Fig.2 Osteoblast-and osteoclast-specific genes expression

2.4 GABA對高脂膳食小鼠股骨氧化還原狀態的影響

如表4所示，HFD組相較于對照組GSH/GSSG比值顯著下降，T-AOC、SOD顯著降低，MDA含量上升（P＜0.05）。相對HFD組，0.06 g/dL GABA組股骨MDA含量顯著降低（P＜0.05），GSH/GSSG比值上升（P＞0.05）；0.12 g/dL GABA組GSH/GSSG比值顯著上升，T-AOC顯著提高，同時氧化損傷MDA含量顯著降低（P＜0.05）。表明外源性GABA進入體內，能夠改善股骨氧化還原狀態，且0.12 g/dL作用優于0.06 g/dL的。

表4 各組小鼠股骨氧化還原狀態（±s）Table 4 Femoral oxidative redox status of mice in different groups（±s）

表4 各組小鼠股骨氧化還原狀態（±s）Table 4 Femoral oxidative redox status of mice in different groups（±s）

項目0.41±0.02b對照組0.06 g/dL0.36±0.04aHFD+GABA組0.38±0.02ab0.40±0.03bHFD組0.12 g/dLGSH/GSSGT-AOC2.12±0.12bSOD 10.58±0.90bMDA 1.48±0.95a1.56±0.20a8.54±0.71a8.87±1.42ab8.41±1.72a2.01±0.17a2.53±0.45b2.09±0.24b1.81±0.30a1.78±0.29a

2.5 GABA對高脂膳食小鼠GABA信號分子和GSK3β/Nrf2表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，HFD組GAD67下調（P＞0.05），GAD65顯著下調（P＜0.05），GABAbR1異常上調（P＜0.05），推測高脂膳食小鼠對GABA存在需求；同時，HFD組小鼠股骨GSK3β表達比正常小鼠顯著上調，Nrf2表達顯著下調 （P＜0.05），表明HFD組Nrf2抗氧化系統抵抗氧化應激能力下降。而相對HFD組，補充0.06 g/dL、0.12 g/dL GABA組GABAbR表達顯著恢復至正常水平 （P＜0.05），GAD65不同程度提高，同時股骨GSK3β和Nrf2表達恢復正常水平。

圖3 GAD、GABAbR1和GSK3β、Nrf2表達Fig.3 Expression of GAD，GABAbR1 and GSK3β，Nrf2

2.6 相關性分析

相關性分析可知，股骨MDA與股骨鈣含量（r=-0.422）、骨骼指數 （r=-0.526）、骨強度 （r=-0.406）顯著負相關（P＜0.05），與股骨長度（r=-0.503）極顯著負相關 （P＜0.01）；T-AOC與股骨長度 （r= 0.494）、骨骼指數（r=0.460）、灰分（r=0.553）、骨強度（r=0.471）顯著正相關（P＜0.05）；GSH/GSSG與股骨長度（r=0.807）、鈣含量（r=0.562）極顯著正相關（P＜0.01），表明氧化應激是股骨性能下降的重要原因。同時，GAD65與Nrf2極顯著正相關 （r=0.624，P＜0.01），GABAbR1與GSK3β（r=0.585）極顯著正相關，與Nrf2（r=-0.568）極顯著負相關（P＜0.01），表明GABA信號異常可能是Nrf2表達下調的重要原因。

3 討論

已有研究證實，高脂膳食下氧化應激會導致動物體內骨代謝失衡、股骨性能下降[1-2]。本研究結果表明，飲食干預第20周，HFD組股骨出現嚴重氧化應激，尿鈣及羥脯氨酸含量顯著高于對照組且股骨及脛骨性能下降，這與前人研究結果基本一致。體外試驗證實，GABA能夠捕獲脂肪氧化過程中的中間產物，并直接與MDA反應生成熒光或非熒光產物，從而減少MDA生成量[13]；體內試驗進一步證實，外源GABA可提高機體抗氧化酶活，減輕氧化損傷[4]。本試驗結果顯示，補充0.06、0.12 g/dL GABA能夠不同程度改善股骨氧化還原狀態，同時顯著降低尿鈣和羥脯氨酸含量，使股骨及脛骨相關性能參數恢復至正常水平；其中，補充0.12 g/dL GABA作用優于補充0.06 g/dL的。相關性分析表明，抗氧化物質GSH/GSSG、T-AOC與股骨相關性能指標存在顯著或極顯著正相關，MDA與股骨相關性能指標顯著負相關。由此推斷，GABA可能通過減輕高脂膳食小鼠股骨氧化應激，平衡骨代謝，提高股骨和脛骨性能。本研究進一步從分子水平證實，HFD組骨細胞分化失衡，而補充GABA可平衡骨細胞分化，即提高成骨細胞分化標志基因col1a1、BGLAP2表達，降低RANKL/OPG比值及破骨細胞分化標志基因TRAP、CTSK表達，這在一定程度上解釋了GABA平衡骨代謝、提高骨性能的分子機制。

GABA具有減輕股骨氧化應激的作用，可能與成骨細胞表達的GABAbR有關。Nrf2是骨組織中抵抗氧化應激的重要核轉錄因子[14]，通過進入細胞核與抗氧化反應元件ARE結合，啟動II相抗氧化酶表達[15]。長期氧化應激會激活GSK3β，進而磷酸化相關激酶導致Nrf2出核降解[7]。而相關研究證實，GABAbR介導的生理功能可促進GSK3β磷酸化失活[8]，這可能間接有利于Nrf2入核。本試驗中，HFD組股骨GAD65比對照組顯著下調，GABAbR表達顯著上調（P＜0.05），推測GABA可能合成不足，骨組織微環境中GABA濃度過低；給高脂膳食小鼠補充一定劑量GABA后，相對HFD組，GABAbR表達恢復至正常水平，可能外源性GABA進入機體補充其生理濃度，滿足了股骨需求。有研究指出，高糖環境下胰島β細胞游離ATP水平增加，抑制GAD65表達，釋放的GABA水平降低[16]。高脂膳食小鼠股骨GAD65表達水平下降可能與機體異常糖脂代謝相關，作用機制有待進一步探討。伴隨著高脂膳食小鼠股骨GABAbR顯著上調，GSK3β表達未被抑制，可能該受體高表達是機體代償性表現，并非GABA信號活躍；而補充GABA后伴隨著股骨GABAbR表達恢復正常，GSK3β下調，Nrf2表達上調，可能此時GABAbR介導外源GABA對GSK3β的正常抑制作用，間接提高Nrf2表達。相關性分析表明，GABA信號分子GAD65、GABAbR和GSK3β、Nrf2存在相關，表明干預異常GABA信號分子表達可能有利于Nrf2表達恢復。

4 結語

研究表明，GABA可改善股骨氧化還原狀態，從分子水平干預骨細胞分化，平衡骨代謝，提高股骨及脛骨性能；0.12 g/dL GABA改善股骨氧化應激和股骨性能的作用優于 0.06 g/dL；GABA可恢復GABAbR表達，抑制GSK3β和提高Nrf2 mRNA表達水平，而其對Nrf2的促進作用是否通過GABAbR抑制GSK3β實現，有待進一步證實。總之，GABA在干預骨質疏松方面具有潛在的生理功能和應用前景。

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Effect of γ-Aminobutyric Acid on Bone Performance in High-Fat-Diet-Fed Mice

TIAN Yingjie1， SUN-Jin1，2， XIE Zhenxing1， MA Yuhua1， LE Guowei1，2， SHI Yonghui*1，2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

This manuscript was aimed to investigate the effect of γ-aminobutyric acid on bone performace in high-fat-diet-fed mice.For this，6-week-old C57BL/6 male mice（40）were randomly divided into four groups：normal diet group（C），high-fat diet group（HFD），mice in HFD supplemented with 0.06%，0.12%GABA by drinking water.A week prior to sacrifice，mice were placed in metabolism cages to collect urine for measuring urinary calcium and hydroxyproline content.Mice were sacrificed by 20th，femur，tibia were collected for measuring parameters，femoral oxidative stress and relative genes expression by RT-PCR.The results demonstrated compared withthe control group，HFD showed femoral oxidative stress，down-regulated GAD65 and increased GABAbR1 expression as well as dramatically significantly up-regulated GSK3β and down-regulated Nrf2；In addition，mice in HFD showed significantly reduced femoral and tibial performance，while dramatically increased urinary calcium and hydroxyproline content.At the same time，osteoblastspecific genes Col1a1，BGLAP2 significantly down-regulated while osteoclast-specific genes expression RANKL/OPG，TRAP，CTSK increased significantly in HFD.0.06% ，0.12%GABA supplement can significantly recovered GSK3β，Nrf2，GABAbR1 expression，alleviated femoral oxidative stress，and thus improved femur and tibia performance accompanied by balanced bone metabolism.Conclusion：GABA can balance bone metabolism and partially recoverbone performance by alleviating oxidative stress.0.12%GABA showed a better effect than 0.06%in adjusting femoral redox state and improving bone performance.

γ-aminobutyric acid，bone performance，high-fat diet，oxidative stress，mice

R 151.2

A

1673—1689（2015）03—0267—07

2014-04-21

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目。

*通信作者：施用暉（1955—），女，上海人，農學博士，教授，碩士研究生導師，主要從事營養代謝調控研究。E-mail：yhshi2009@126.com