內切葡聚糖酶與木聚糖酶在畢赤酵母中的共分泌表達

劉高磊， 胡 蝶， 鄔敏辰， 殷 欣， 汪俊卿

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫214122）

內切葡聚糖酶與木聚糖酶在畢赤酵母中的共分泌表達

劉高磊1， 胡 蝶2， 鄔敏辰*3， 殷 欣2， 汪俊卿2

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫214122）

為實現內切葡聚糖酶和木聚糖酶在畢赤酵母中的共分泌表達，進而降低酶制劑的生產成本，構建含木聚糖酶基因的重組表達載體pPICZαA-Aoxyn11A，經Sac I線性化后，電轉化至含內切葡聚糖酶基因Aucel12A的重組畢赤酵母GSC7中，獲得雙重重組畢赤酵母GSCX8。經甲醇誘導表達后，GSCX8發酵上清液中內切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分別為47.77 IU/mL和192.71 IU/mL，為單獨表達菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶學性質分析顯示，內切葡聚糖酶的最適pH為4.0，在pH 3.0～8.5穩定；最適溫度為50℃，在60℃以下穩定。木聚糖酶的最適pH為5.5，在pH 3.0～10.0穩定；最適溫度為55℃，在50℃以下穩定。GSCX8遺傳穩定性測試結果表明，內切葡聚糖酶和木聚糖酶在畢赤酵母中實現了穩定的共表達。

內切葡聚糖酶；木聚糖酶；畢赤酵母；共分泌表達

內切-1，4-β-D-葡聚糖酶 （EG，endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4）是纖維素酶系的重要組成部分，它可在纖維素鏈上隨機切割β-D-1，4-葡糖苷鍵生成較小相對分子質量的纖維寡糖[1]。內切-β-1，4-D-木聚糖酶（β-1，4-endoxylanase，EC 3.2.1.8）通過作用于木聚糖主鏈內部的β-D-1，4-木糖苷鍵，將半纖維素的主要成分之一木聚糖降解為低聚木糖[2]。兩種酶在食品加工、釀酒、飼料加工，以及生物能源等領域都有重要的應用價值[3-4]。

在植物細胞壁中，木聚糖和甘露聚糖等半纖維素的主要成分在纖維素周圍形成復雜的網狀結構，在酶催化水解過程中，阻礙了酶分子與底物的有效結合。然而，在纖維素酶與半纖維素酶的聯合作用下，可在一定程度上打破空間位阻，從而提高纖維素和半纖維素的水解率。Zhang等[5]研究發現，來源于GH11和GH10家族的2種耐熱木聚糖酶在水解麥麩時均可與纖維素酶發生協同作用。Anikó Várnai等[6]發現，木聚糖酶、甘露聚糖酶和纖維素酶聯合催化預處理的軟木時，多糖的總水解率遠大于3種酶單獨作用時的水解率之和。目前，國內外已有關于構建功能相關蛋白質共表達菌株的報道，通過將多個外源基因在同一宿主中共表達，降低外源蛋白質的生產成本。黃生平等[7]構建了一個雙基因表達分泌質粒pHBM907-phyA-man，在畢赤酵母中實現了植酸酶和甘露聚糖酶的分泌表達。高秋芳等[8]將pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC質粒同時轉化到畢赤酵母中，獲得了一株高效表達木聚糖酶和果膠酶的畢赤酵母菌株PX6。

作者所在研究室前期克隆了一種來源于宇佐美曲霉 （Aspergillus usamii）E001的內切葡聚糖酶基因Aucel12A（GenBank登錄號：JN128871）和一種來源于米曲霉（Aspergillus.oryzae）CICC41086的木聚糖酶基因 Aoxyn11A （GenBank登錄號：XM_001823746）。本課題研究過程中將Aoxyn11A基因連接到pPICZαA表達質粒上，轉化至含有pPIC9K-Aucel12A的重組畢赤酵母中，構建雙重重組畢赤酵母，成功實現了內切葡聚糖酶和木聚糖酶的共分泌表達，該研究進展國內尚未見報道。同時，對重組表達的這兩種酶的酶學性質及雙重重組畢赤酵母的遺傳穩定性進行了研究。本研究中構建了雙酶表達，降低了生產成本，可為多個功能相關的外源蛋白質在畢赤酵母中的共表達提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和培養基

克隆宿主菌E.coli DH5α，購自上海Sangon公司；表達宿主菌 P.pastoris GS115、表達質粒pPICZαA，購自 Invitrogen公司；重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-Aucel12A、 含 木 聚 糖 酶 基 因（Aoxyn11A）的重組克隆質粒pUCm-T-Aoxyn11A，由作者所在實驗室構建并保存。大腸桿菌生長培養基LB和篩選培養基低鹽LB（+Zeocin）、畢赤酵母生長培養基YPD、轉化及篩選培養基MD、YPDS（+ Zeocin）及誘導培養基BMGY、BMMY，均由作者依據Invitrogen公司操作手冊配制。

1.2 主要試劑

DNA Maker、低蛋白質分子量標準、各種限制性內切酶 （EcoR I、Not I、Sac I）、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶等，購自大連TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒，購自BBI公司；Zeocin，購自Invitrogen公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、櫸木木聚糖（Beechwood xylan），購自Sigma公司；其它試劑均為國產或進口分析純。

1.3 重組表達質粒pPICZαA-Aoxyn11A的構建

以堿裂解法大量提取pUCm-T-Aoxyn11A和pPICZαA質粒，分別用EcoR I和Not I雙酶切，酶切產物經質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收約600 bp的Aoxyn11A基因片段和約3.6 kb的pPICZαA載體片段，經T4 DNA連接酶16℃連接過夜，然后轉化至 DH5α感受態細胞，利用含25 μg/mL Zeocin的低鹽LB平板篩選陽性克隆。篩選的陽性克隆用通用引物 5′-AOX1（GACTGGTTCCAATTGACAAGC） 和 3′-AOX1（GCAAATGGCATTCTGACATCC）進行菌液PCR驗證，并送上海Sangon公司測序，測序正確的重組表達質粒命名為pPICZαA-Aoxyn11A。

1.4 畢赤酵母細胞的電擊轉化及篩選

重組表達質粒pPICZαA-Aoxyn11A和表達質粒pPICZαA經Sac I單酶切使之線性化后，分別用電穿孔法轉化至畢赤酵母GS115和重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-Aucel12A（命名為GSC7）中，轉化后的菌液涂布于含200 μg/mL Zeocin的YPDS平板上，30℃條件下培養2～3 d至出現轉化子。電轉化及篩選方法參見Invitrogen公司操作手冊。篩選到的重組畢赤酵母菌株分別命名為GS115/pPICZαA-Aoxyn11A和GS115/pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A。

1.5 目的基因的誘導表達

從YPDS（+Zeocin）篩選平板上隨機挑取若干重組畢赤酵母單菌落，接種于裝有30 mL BMGY培養基的250 mL的三角瓶中，30℃、220 r/min振蕩培養至OD600為2～4，室溫下4 000 r/min離心5 min收集菌體，并重懸于30 mL BMMY培養基中，30℃、220 r/min條件下誘導96 h，每隔24 h補加甲醇至終體積分數為2.0%。誘導結束后，4℃、8 000 r/min離心10 min，收集發酵上清液進行酶活性測定和SDS-PAGE分析。

1.6 重組畢赤酵母的基因組提取及PCR擴增

挑取畢赤酵母重組子單菌落接種于YPD液體培養基中，于30℃條件下培養至適當濃度后，離心收集菌體，參照文獻 [11]的方法抽提酵母基因組DNA。以提取的不同重組畢赤酵母（GS115/pPIC9KAucel12A、GS115/pPICZαA-Aoxyn11A 和 GS115/ pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A）基因組DNA作為模板，分別利用引物celF、celR和xynF、xynR擴增內切葡聚糖酶基因Aucel12A和木聚糖酶基因Aoxyn11A，PCR所用引物見表1。PCR擴增產物經質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測目的基因在畢赤酵母染色體上的整合情況。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.7 表達產物的SDS-PAGE鑒定

取20 μL誘導表達96 h的發酵上清液，采用質量分數5%的濃縮膠與質量分數12%的分離膠進行SDS-PAGE梯度電泳，電泳后的蛋白膠用考馬斯亮藍R-250染色，脫色液脫色至蛋白質條帶清晰可見，分析重組酶的分泌表達情況，并進行表觀分子量的測定。

1.8 重組表達酶的活力測定

參照文獻[9-10]的DNS定糖法并略做改進，測定內切葡聚糖酶和木聚糖酶的活力。2.4 mL最適pH的底物溶液中，加入100 μL稀釋適當倍數的酶液，于最適反應溫度條件下孵育15 min，反應通過加入2.5 mL的DNS試劑并煮沸7 min進行終止和顯色，并用分光光度計測定540 nm處的吸光值。內切葡聚糖酶和木聚糖酶的測定底物分別為1 g/dL的CMC-Na溶液 （用0.1 mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制，pH 4.0）和0.5 g/dL的櫸木木聚糖溶液（用0.1 mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制，pH 5.5）。在上述最適反應條件下，每分鐘水解底物生成相當于1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位（IU），其中內切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶活計算分別以D-葡萄糖、D-木糖為標準單糖。

1.9 重組酶酶學性質分析

1.9.1 酶的最適反應pH及pH穩定性分別以Na2HPO4-檸檬酸緩沖液 （pH 3.0～7.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 7.5～8.5）、甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0～10.0）配制底物溶液，在最適反應溫度下測定不同pH值時的酶活性，以某一pH值下的最高酶活為100%計算相對酶活，確定酶的最適反應pH。將酶液分別用不同pH值 （pH 3.0～10.0）的緩沖液稀釋，40℃保溫1 h，冷卻后在最適反應條件下測定殘余酶活性，以未經pH處理的最高酶活力為100%計算相對酶活，分析酶的pH穩定性。

1.9.2 酶的最適反應溫度及熱穩定性選取最適pH的底物溶液，分別在不同溫度（30～80℃）測定酶活性，以某一溫度下的最高酶活為100%計算相對酶活，確定酶的最適反應溫度。將酶液置于不同溫度（30～80℃）保溫30 min后，立即冰浴冷卻，在最適反應條件下測定殘余酶活性，以未經熱處理的最高酶活為100%計算相對酶活，分析酶的熱穩定性。

1.10 雙重重組畢赤酵母的遺傳穩定性測試

選取篩選到的雙重重組畢赤酵母 GS115/ pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A高產菌株，在YPD平板上連續劃線傳代培養10次后，分別將各代菌株以高密度搖瓶方式在體積分數2.0%甲醇流加量條件下誘導產酶，30℃、220 r/min振蕩培養96 h后，測定發酵上清液中內切葡聚糖酶與木聚糖酶表達量，進而評價共表達畢赤酵母工程菌株的遺傳穩定性。

2 結果與討論

2.1 酵母重組表達載體的鑒定

從低鹽LB（+Zeocin）篩選平板上挑取若干轉化子，以通用引物5′-AOX1/3′-AOX1進行菌液PCR驗證，質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，陰性對照DH5α/pPICZαA的菌液PCR產物可見約600 bp的載體片段，而DH5α/pPICZαA-Aoxyn11A的菌液PCR產物可見約1 200 bp（含載體片段約600 bp，Aoxyn11A基因片段約600 bp）的DNA片段，見圖1。說明目的基因Aoxyn11A已插入到pPICZαA載體的5′-AOX1與3′-AOX1之間。測序結果與預期相符，表明酵母重組表達載體pPICZαA-Aoxyn11A構建正確。

圖1 重組大腸桿菌DH5α/pPICZαA-Aoxyn11A的菌液PCR鑒定Fig.1 Identification ofrecombinantE.coliDH5α/ pPICZαA-Aoxyn11A by bacterium liquid PCR

2.2 雙重重組畢赤酵母的表達與產物分析

隨機挑取 10個 GS115/pPIC9K-Aucel12A/ pPICZαA-Aoxyn11A菌落 （分別命名為GSCX1—10）和 1個 GS115/pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA陰性對照菌落（命名為GSCZ），30℃、體積分數2%甲醇流加量條件下誘導96 h后，分別在最適反應條件下測定上清液中的內切葡聚糖酶和木聚糖酶活。由表2可知，GSCZ的表達產物只具有內切葡聚糖酶活性，而GS115/pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A可同時表達內切葡聚糖酶和木聚糖酶；其中GSCX8的產酶能力最強，上清液中的內切葡聚糖酶和木聚糖酶活力分別達到47.77 IU/mL和192.71 IU/mL。GSCX8成功實現了內切葡聚糖酶和木聚糖酶在畢赤酵母中的共表達，但兩種酶的表達水平比單獨表達時有所降低，其中木聚糖酶的表達量約相當于重組酵母表達菌株GS115/pPICZαA-Aoxyn11A（命名為GSX5，酶活力為233.38 IU/mL）的80%，而內切葡聚糖酶的表達量約相當于陰性對照GSCZ和前期研究中構建的GS115/pPIC9K-Aucel12A表達量最高的菌株的85%，這可能與畢赤酵母有限的分泌表達外源蛋白質的能力有關[13]。選取表達量最高的GSC7、GSX5和GSCX8菌株用于后續研究。

2.3 重組畢赤酵母的PCR檢測

為檢測目的基因是否已整合到畢赤酵母染色體上，以重組畢赤酵母GSC7、GSX5及GSCX8的基因組為模板進行PCR擴增驗證。

表2 GS115/pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A的表達分析Table 2 Expression analysis GS115/pPIC9K-Aucel12A/ pPICZαA-Aoxyn11A

將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示以GSC7基因組為模板，利用引物celF/celR進行PCR擴增，可擴增出一條約700 bp的條帶（圖2，泳道1），大小與Aucel12A基因片段一致，而利用引物xynF/xynR進行擴增未出現任何條帶 （圖2，泳道2）；以GSX5基因組為模板，利用引物celF/celR進行擴增未出現任何條帶（圖2，泳道3），而利用引物xynF/xynR可擴增出一條約600 bp的條帶（圖2，泳道4），大小與Aoxyn11A基因片段一致；以GSCX8基因組為模板，利用celF/celR和xynF/xynR兩對引物可分別擴增出約700 bp（圖2，泳道5）和600 bp（圖2，泳道6）的條帶，表明木聚糖酶基因Aoxyn11A已整合到畢赤酵母基因組中，而原有的內切葡聚糖酶基因Aucel12A沒有丟失。

2.4 表達產物的SDS-PAGE分析

取重組畢赤酵母GSK（GS115/pPIC9K）、GSC7、GSZ（GS115/pPICZαA）、GSX5、GSCZ、GSCX8的發酵上清液，用SDS-PAGE分析蛋白質的表達情況。結果顯示，GSC7的表達產物在相對分子質量約27.0 kDa處出現了一條特異性條帶，大于內切葡聚糖酶的理論分子質量24.3 kDa，內切葡聚糖酶含有一個潛在的N糖基化位點（N–W–T），在畢赤酵母中表達時可能會發生翻譯后的糖基化修飾，因此推斷該蛋白質條帶為重組表達的內切葡聚糖酶；GSX5的表達產物在相對分子質量約24.6 kDa處出現了一條特異性的蛋白質條帶，與前期測得的木聚糖酶的表觀分子量相符[12]；GSCX8的表達產物在相對分子質量約27.0、24.6 kDa處均可見目的蛋白質表達條帶，而陰性對照GSCZ僅可見相對分子質量約27.0 kDa的特異性條帶，見圖3，這與酶活測定的結果一致。

圖2 重組畢赤酵母的PCR檢測Fig.2 Verification of recombinant Pichia pastoris by PCR

圖3 重組畢赤酵母表達產物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed products by recombinant Pichia pastoris

2.5 酶學性質分析

用雙重重組畢赤酵母GSCX8分泌表達的混合酶，分別對重組內切葡聚糖酶和重組木聚糖酶的酶學性質進行分析。

2.5.1 最適pH及其穩定性內切葡聚糖酶的適宜作用pH為pH 3.5～4.5，其相對酶活在80%以上，其中最適作用pH為4.0；木聚糖酶酶在pH 4.5～6.5的適宜作用pH條件下酶活較高（＞80%），其中最適作用pH為5.5，見圖4。

圖4 內切葡聚糖酶和木聚糖酶的最適作用pHFig.4 Optimal pH profile of endoglucanase and xylanase

內切葡聚糖酶在pH 3.0～8.5范圍內穩定，殘余酶活保持在80%以上，而木聚糖酶在pH 3.0～10.0內酶活均能保持穩定（＞80%），見圖5。

圖5 內切葡聚糖酶和木聚糖酶的pH穩定性Fig.5 pH stability of endoglucanase and xylanase

2.5.2 最適反應溫度及其穩定性內切葡聚糖酶在40～60℃之間酶活較高（＞80%），其中最適作用溫度為50℃；木聚糖酶在45～60℃之間活性較高（＞80%），其中最適作用溫度為55℃，見圖6。

圖6 內切葡聚糖酶和木聚糖酶的最適作用溫度Fig.6 Optimal temperature of endoglucanase and xylanase

內切葡聚糖酶在60℃以下酶活較穩定（＞80%），65℃保溫30 min后，酶活下降到39.3%；木聚糖酶在50℃以下酶活較穩定（＞80%），55℃保溫30 min后，酶活下降到20.7%，見圖7。

圖7 內切葡聚糖酶和木聚糖酶的熱穩定性Fig.7 Thermostability of endoglucanase and xylanase

2.6 雙重重組畢赤酵母的遺傳穩定性

雙重重組畢赤酵母GSCX8經傳代培養10次后，分別將各代菌株以搖瓶發酵方式誘導產酶96 h，檢測發酵上清液的酶活性。其中內切葡聚糖酶酶活在 43.85～49.14 IU/mL，木聚糖酶酶活 178.94～201.82 IU/mL，表明GSCX8在連續傳代培養10次后，內切葡聚糖酶和木聚糖酶的表達量在各代中基本保持穩定，顯示具有良好的遺傳穩定性。

3 結語

巴斯德畢赤酵母作為近年來發展迅速的真核表達系統，具有表達水平高、可分泌表達及遺傳穩定等優點，將功能相關的酶基因在畢赤酵母中共表達，實現多種酶分泌表達，且重組表達的蛋白質純度較高[12]。在本研究中，通過雙質粒體系構建了整合有Aucel12A基因和Aoxyn11A基因的雙重重組畢赤酵母GSCX8，其發酵上清液中內切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶活性分別為47.77、192.71 IU/mL，為單獨表達菌株GSC7和GSX5酶活性的85%和80%。GSCX8經傳代培養10次后，仍具有良好的遺傳穩定性，從而實現了內切葡聚糖酶與木聚糖酶在畢赤酵母中的穩定共表達。

GSCX8分泌表達的重組酶的酶學性質分析顯示：內切葡聚糖酶和木聚糖酶具有相近的最適催化條件，從而可以在同一反應體系以復合酶的形式聯合催化，從而發揮協同效應。本研究通過雙質粒表達體系，實現了內切葡聚糖酶和木聚糖酶在畢赤酵母中的共表達，并對重組酶的酶學性質進行了初步研究，為新型復合酶的制備提供了有益借鑒，為進一步研究協同作用奠定了基礎。

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Co-Expression of Endoglucanase and Xylanase in Pichia pastoris

LIU Gaolei1， HU Die2， WU Minchen*3， YIN Xin2， WANG Junqing2
（1.School of Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Both endoglucanase and xylanase are additives in feed for mono-gastric animal.Coexpression of endoglucanase and xylanase in P.pastoris is a useful way to reduce the production cost in feedstuff industry.An endoglucanase-encoding gene（Aucel12A）from Aspergillus usamii was expressed in P.pastoris，and the engineering strain with the highest endoglucanase activity was labeled GSC7.Then，a recombinant vector，pPICZαA-Aoxyn11A，was constructed and linearized by Sac I，followed by transforming it into GSC7.Ultimately，the endoglucanase and xylanase genes were successfully co-expressed in P.pastoris.One strain harbored genes Aoxyn11A and Aucel12A，with the highest xylanase and endoglucanase activities，was labeled GSCX8.The enzymatic properties of the recombinant AuCel12A and AoXyn11A，expressed in GSCX8，were characterized.Meanwhile，to analyze the genetic stability of GSCX8，the xylanase and endoglucanase activities of different strainsafter passing 10 generations were also measured.After strain GSCX8 was induced for 96 h，the activities of recombinant AuCel12A and AoXyn11A in the cultured supernatant were 47.77 IU/mL and 192.71 IU/mL，respectively，which were about 85%and 80%of that of enzymes expressed by the single gene engineering strains GSCZ and GSX5.The recombinant AuCel12A displayed the optimal activity at pH 4.0 and 50℃，and was stable over a pH range of 3.0～8.5 and at 60℃or below.Besides，the recombinant AoXyn11A displayed the optimal activity at pH 5.5 and 55℃，and was stable over a pH range of 3.0～10.0 and at 50℃or below.Additionally，the activities of the two enzymes were well maintained after the GSCX8 passing 10 generations.

endoglucanase，xylanase，Pichia pastoris，co-expression

Q 814

A

1673—1689（2015）03—0253—07

2014-04-17

國家自然科學基金項目（31101229；31271811）。

*通信作者：鄔敏辰（1962—），男，江蘇無錫人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事酶工程與基因工程研究。

E-mail：biowmc@126.com