哈密瓜在致病菌侵染前后細胞超微結(jié)構(gòu)的變化

單春會， 陳 衛(wèi)， 唐鳳仙， 馬偉榮， 柳 濤

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.石河子大學 食品學院，新疆 石河子832003）

哈密瓜在致病菌侵染前后細胞超微結(jié)構(gòu)的變化

單春會1，2， 陳 衛(wèi)*1， 唐鳳仙2， 馬偉榮2， 柳 濤2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2.石河子大學 食品學院，新疆 石河子832003）

病原真菌通常會產(chǎn)生侵染墊、附著胞和吸器等侵染結(jié)構(gòu)來完成對寄主的侵染。通過電鏡觀察不同時間不同病原菌對哈密瓜的侵染狀況。試驗結(jié)果表明，病原菌會導致哈密瓜細胞結(jié)構(gòu)變化，例如細胞壁變薄，葉綠體解體，細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，出現(xiàn)空泡化等一系列發(fā)病特征。研究結(jié)果為哈密瓜病原菌侵染過程，以及哈密瓜侵染性病害的防治提供了理論依據(jù)。

哈密瓜；病原菌侵染；超微結(jié)構(gòu)；電鏡

作者通過電子顯微鏡對不同致病菌對哈密瓜的侵染過程進行觀察，更深入地了解病原菌的侵染途徑，以及侵染過程中細胞結(jié)構(gòu)的變化情況，為哈密瓜的貯藏保鮮及對哈密瓜病原菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品為大田種植的新疆哈密瓜厚皮品種八成熟伽師瓜，大小均勻，無蟲眼，無損傷。病原菌來自石河子大學食品學院已分離純化的菌株。液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d，待菌液渾濁時開始接菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法將哈密瓜表皮用干凈的濕布擦干凈，晾干。每種致病菌分3種方法接菌：一是用直徑為1 cm的打孔器打深約2 cm的孔，用微量注射器吸取菌液注射至孔內(nèi)，并用保鮮膜包裹接菌處；二是用已消毒的牙簽在哈密瓜表皮劃出深約1 cm的Z型或S型曲線，用微量注射器吸取菌液注射至孔內(nèi)，并用保鮮膜包裹接菌處；三是將哈密瓜表皮輕輕刮去，滴3～5滴菌液，用涂抹棒涂抹均勻，并用保鮮膜包裹接菌處。實驗所用器具均用高溫殺菌或酒精燈加熱殺菌，每種方法做3個平行，觀察不同時間內(nèi)病原菌的生長情況。分別在0、48、96 h取樣，取樣時分別在患處菌株生長明顯部位作橫切和縱切，切片為約0.5 cm×0.2 cm×0.1 cm的小塊，未接菌的哈密瓜樣品作對照。

1.2.2 制片方法將切出的小塊材料放入盛有質(zhì)量分數(shù)4%戊二醛的玻璃容器內(nèi)，固定4 h，用磷酸緩沖液浸洗4次，15 min/次。用質(zhì)量分數(shù)1%餓酸固定2 h，磷酸緩沖液浸洗3次，15 min/次[2]。用體積分數(shù)30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇，逐級脫水，每級15 min。用醋酸異戊醋置換2次，第1次停留置換15 min，第2次停留置換30 min，將玻璃容器內(nèi)過多的醋酸異戊醋倒掉，余液蓋過樣品表面。然后連同玻璃容器一起放入真空鐘罩內(nèi)，慢慢打開真空排氣閥，保持l h，讓醋酸異戊醋在真空狀態(tài)下蒸發(fā)而達到樣品干燥的目的。最后將樣品置于電子顯微鏡下，掃描觀察哈密瓜不同致病菌的侵染情況[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 未接菌哈密瓜切片電鏡圖

由圖1（a）（b）（c）（d）中可以看出：切口方向為從右向左，細胞壁沒有降解，依然保持著完整性，整體細胞沒有明顯受到侵蝕的特征，葉綠體有個別因成熟解體，細胞內(nèi)各項細胞器較完整，可以看到葉綠體周圍附著的線粒體，所有細胞都保持著成熟細胞的完整特性。

Delphi專家評議賦權(quán)法是一種主觀賦權(quán)法，是基于專家組給出的評價指標的重要性序列值，構(gòu)造兩兩比較設計矩陣，這種根據(jù)序列值的兩兩比較相對于層次分析法的比較矩陣的構(gòu)造要簡單，且比較矩陣也非常簡潔，元素只有0和1，從而大大減少了計算上的復雜性，且其結(jié)果建立在多位專家的兩兩比較設計矩陣基礎上，從而使獲得的權(quán)重具有可靠性。但使用該法時要注意專家必須是相關領域具有豐富的專業(yè)經(jīng)驗和知識。專家在植物觀賞性綜合評價上，不管是指標體系的建立，還是指標重要性序列的給定都必須是專業(yè)的，既要避免遺漏重要指標帶來評價上的偏差，又要避免納入過多無用指標帶來判斷的失誤和不合理的評價。

圖1 未接菌哈密瓜的電鏡觀察圖Fig.1 SEM observation of cantaloupe without inoculation

2.2接種毛霉48 h哈密瓜切片電鏡圖

由圖2（a）處可明顯看出菌絲存在，根據(jù)菌絲的分布，可以看出侵染路徑為右上→左下。由圖2（b）可以看到菌絲存在，細胞器解體，細胞壁被侵蝕。從圖2（c）可以看出眾多細胞器已經(jīng)解體，細胞壁出現(xiàn)空泡化，菌絲集中在細胞壁周圍，細胞壁變得酥松。圖2（d）質(zhì)體空泡化嚴重，細胞質(zhì)變得非常稀薄，各種細胞器正在解體，菌絲比較明顯。

圖2 接菌毛霉48 h的哈密瓜電鏡觀察圖Fig.2 SEM observation of cantaloup inoculated Mucor at 48 hours

2.3 接種毛霉96 h哈密瓜切片電鏡圖

由圖3（a）中可看出，哈密瓜經(jīng)過毛霉96 h的侵染，細胞破壞情況嚴重，有些已經(jīng)不呈現(xiàn)細胞結(jié)構(gòu)，細胞壁胞間層消失。圖3（b）中可看出，毛霉的菌絲大量存在，細胞已經(jīng)喪失結(jié)構(gòu)，細胞器已經(jīng)無法分辨。圖3（c）是一個侵染情況稍輕的細胞，但是細胞壁的情況依舊不容樂觀，葉綠體呈現(xiàn)解體狀態(tài)。圖3（d）是哈密瓜細胞中的細胞壁結(jié)構(gòu)，可以明顯看到，細胞壁出現(xiàn)空泡，說明毛霉的侵染性較強，導致細胞壁已經(jīng)失去其應有的形態(tài)。

2.4 接種青霉48 h哈密瓜切片電鏡圖

從圖4（a）中可看出，青霉是由右下方→左上侵染，但48 h的侵染時間不是很長，所以侵染現(xiàn)象不是特別明顯，哈密瓜的整體細胞還是呈現(xiàn)典型的成熟細胞特性。圖4（b）中可看出，菌絲集結(jié)在導管附近，可判斷青霉菌的侵染路徑是經(jīng)由導管而感染到其他細胞中。圖4（c）可觀察到細胞壁侵蝕情況嚴重，呈拉絲狀，細胞壁中膠層正在消失。圖4（d）可以看出有明顯菌絲，細胞壁呈拉絲狀，且明顯變薄。

圖3 接菌毛霉96 h的哈密瓜電鏡觀察圖Fig.3 SEM observation of cantaloup inoculated Mucor at 96 hours

圖4 接菌青霉48 h哈密瓜切片電鏡觀察圖Fig.4 SEM observation of cantaloup inoculated Penicillium at 48 hours

2.5 接種青霉96 h哈密瓜切片電鏡圖

從圖5（a）中可看出，青霉侵染方向是從右上到左下，侵染路徑明顯，細胞整體狀況良好，胞間層完好。圖5（b）中可看出，細胞壁變薄，葉綠體解體，有明顯的成熟細胞的特征，有大液泡存在。圖5（c）發(fā)現(xiàn)明顯菌絲，細胞器解體嚴重。圖5（d）中顯示細胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)菌絲，說明侵染程度較深，但對細胞整體形態(tài)影響并不大。

圖5 接菌青霉96 h哈密瓜電鏡結(jié)果圖Fig.5 SEM observation of cantaloup inoculated Penicillium at 96 hours

2.6 接種黑曲霉48 h哈密瓜切片電鏡圖

圖6（a）顯示，經(jīng)過黑曲霉48 h的侵染，哈密瓜果實細胞解體情況非常嚴重，細胞整體形態(tài)被嚴重破壞，樣本解體嚴重。從圖6（b）可以看出，在一個細胞形態(tài)相對完整的細胞中，葉綠體已經(jīng)開始解體，并且發(fā)現(xiàn)了菌絲，線粒體依附在葉綠體的邊緣。圖6（c）（d）中可以發(fā)現(xiàn)，跟其他的樣本一樣，哈密瓜果實經(jīng)過侵蝕之后細胞壁明顯變薄，呈拉絲狀，細胞壁中間層消失。

圖6 接菌黑曲霉48 h哈密瓜電鏡結(jié)果圖Fig.6 SEM observation of cantaloup inoculated Aspergillus Niger at 48 hours

2.7 接種黑曲霉96 h哈密瓜切片電鏡圖

圖7（a），根據(jù)細胞解體的嚴重情形可看出，黑曲霉的侵染方向是從右向左。圖7（b）顯示，細胞的葉綠體呈現(xiàn)解體的狀態(tài)，葉綠體基質(zhì)中出現(xiàn)菌絲。從圖7（c）中可以看出，兩細胞之間出現(xiàn)空泡，胞間質(zhì)解體嚴重，導致細胞分離。圖7（d）中可以看出，在細胞的導管附近，發(fā)現(xiàn)大量菌絲以及解體的細胞器，說明黑曲霉有可能也經(jīng)此處侵染。

通過對不同病原菌的侵染情況進行觀察，可以看出能導致哈密瓜發(fā)病的病原菌一般均能導致細胞結(jié)構(gòu)的破壞。其中毛霉的發(fā)病時間較慢，菌絲侵染過程較緩慢，菌絲不明顯，但仍能看到明顯的細胞破壞現(xiàn)象。青霉菌侵染效果較明顯，表明在同等時間下，青霉菌發(fā)病較快，菌絲侵染迅速，對細胞破壞嚴重，細胞內(nèi)看到有明顯的菌絲存在，細胞器變薄，最終破裂。黑曲霉48 h發(fā)病明顯，細胞器雖有破壞但總體細胞器存在；96 h時可以看到細胞壁上出現(xiàn)空泡化，細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)明顯菌絲，細胞壁變薄。從以上電鏡結(jié)果圖可以看出，3種菌的侵染快慢分別為青霉菌、黑曲霉、毛霉菌。

圖7 接菌黑曲霉96 h哈密瓜電鏡結(jié)果圖Fig.7 SEM observation of cantaloup inoculated Aspergillus Niger at 96 hours

3 討論

在植物病原真菌的侵染過程中，侵入期可能是最重要的階段。侵染性植物病害能否發(fā)生，關鍵是侵染能否成功。因此，病菌侵染結(jié)構(gòu)的形成與擴展，對侵染性病害的發(fā)生起著極其重要的作用。病原真菌的侵入過程一般包含：分生孢子粘附在寄主表面、孢子萌發(fā)、附著胞形成、附著胞黑色素化，直至最終進入寄主組織。真菌附著胞的產(chǎn)生對病害的發(fā)生非常重要，它直接影響病原真菌與寄主植物的分子識別，并介導病原菌的侵入和寄主植物防御反應的發(fā)生[5]。對附著胞和吸器進行細胞、亞細胞水平的超微結(jié)構(gòu)、生理生化性質(zhì)，以及基因分子水平的研究[1，6]，了解其作用機制，不僅可以對真菌病害的防治提供理論依據(jù)，而且在仿生學、機械制造及其他工業(yè)領域都將有很高的參考價值。

植物果肉在透射電鏡下表現(xiàn)的微形態(tài)特征，有一定的參考價值，但值得注意的是，植物組織的某些性狀易受環(huán)境條件的影響，所以在選擇觀察時不僅要注意它的穩(wěn)定性，而且還要參考其他性狀進行綜合研究，才能得到客觀、正確的結(jié)論[4-10]。

4 結(jié)語

目前，國內(nèi)針對采后哈密瓜對病原菌侵染的反應機制、病原菌的侵染過程，以及侵染機制的研究較少。與哈密瓜貯藏保鮮密切相關的一個基礎科學問題是采后哈密瓜對霉菌侵染應答的分子機制如何？超微結(jié)構(gòu)變化是怎樣的？因此，研究病原菌侵染前后哈密瓜表皮顯微結(jié)構(gòu)變化，將有助于了解病原菌的侵染過程，揭示病原菌致病和采后哈密瓜抗病的調(diào)控機制，進而為哈密瓜采后病害的無污染防治技術(shù)和綠色保鮮技術(shù)，提供理論支持和依據(jù)。

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Observation on Alteration of Cellar Ultrastructure of Cantaloupe Before and After Infected by Pathogen

SHAN Chunhui1，2， CHEN Wei1， TANG Fengxian2， MA Weirong2， LIU Tao2
（1.School of Food Science and Technology，Jingnan University，Wuxi 214122，China；2.Food College，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

In recent years，more and more studies of concentrated on the plant pathogenic fungi infects plant structure.Pathogenic fungi usually produce infection pad，attached to infect cells and absorbing structures，etc.to complete the host infection process.The infection status of cantaloupe infected by different pathogen at different times was observed throngh electron microscop.The results showed that the incidence of pathogens can cause cantaloupe changes in cell structure，such as cell wall thin，chloroplasts disintegration，destruction of the cell structure，vacuoles and a series of clinical characteristics.The research conclusion will provide theoretical basis for the cantaloupe pathogen infection process，and infectious disease prevention and control，it has a certain reference value.

cantaloupe，pathogen infection，ultrastructure，electron microscopy

S 432.4；TS 201.3

A

1673—1689（2015）03—0232—07

2014-03-25

國家自然科學基金項目（31360412）。

單春會（1978—），男，新疆石河子人，工學博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)的研究。E-mail：350077747@qq.com

*通信作者：陳衛(wèi)（1966—），男，江蘇揚州人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品微生物學研究。

E-mail：weichen@jiangnan.edu.cn