凝結芽孢桿菌JSSW-07對異育銀鯽生長及免疫功能的影響

張維娜， 夏 飛， 謝 駿， 高 亮， 孫 梅， 陳秋紅， 匡 群， 鄒蘇艷，張憲中

(1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無錫 214063;2.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇 無錫 214081;3.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇 無錫 214081;4.江蘇宜興天石飼料有限公司，江蘇 宜興 214200;5.無錫市水產技術指導站，江蘇 無錫 214000)

在水產養殖中，水生動物頻繁遭受各類應激因子的刺激，容易導致其機體免疫力降低，病害頻繁發生。目前，有關魚類病害的傳統防治方法多是使用抗生素，大量、盲目使用抗生素不但防治效果差，并且還容易造成藥物殘留、耐藥性增加、魚類內臟機能損傷等許多不良后果［1］。近年來，在水產養殖中益生菌的使用已日趨普遍。Verschuere等［2］認為，益生菌是一類活的微生物制劑，通過改善養殖環境、增強機體抗病能力、提高飼料營養價值或飼料利用率、調節宿主或環境微生物菌群平衡而對宿主產生有益作用。目前，益生菌在水產養殖業中的應用方式主要包括3種:改良養殖水體的水質;控制病原，生物防治;作為營養性飼料添加劑，提高動物生長性能。益生菌因其安全、有效的優點正逐步替代抗生素在水產養殖中的使用。

芽孢桿菌是水產養殖行業應用最廣泛的益生菌之一［3-5］。芽孢桿菌能夠分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，促進營養物質在水生動物消化道的分解和吸收，提高飼料的利用率和消化率。同時，芽孢桿菌被證明具有抗菌活性，能夠產生細菌素(抗菌肽)，對水產動物具有免疫刺激作用。凝結芽孢桿菌是一種既產乳酸又產芽孢的乳酸菌，已被中國農業部列入飼料添加劑質量保護期內的新型飼料添加劑，美國食品藥品監督管理局(FDA)也將凝結芽孢桿菌列為“普遍認為安全”的桿菌類。凝結芽孢桿菌作為一種新型的芽孢桿菌，在水產養殖中具有廣闊的應用前景。但是目前凝結芽孢桿菌在水產養殖應用方面的研究較少，考察其對異育銀鯽生長、免疫影響的報道很少。因此，本試驗在異育銀鯽基礎日糧中添加凝結芽孢桿菌JSSW-07粉劑，考察凝結芽孢桿菌作為飼料添加劑對鯽魚生長、生理生化指標的影響，為研究微生態制劑對水生動物的作用機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

凝結芽孢桿菌(菌株JSSW-07)制劑(菌濃度為5.0×108CFU/g)由江蘇省蘇微微生物研究有限公司經發酵、過濾、烘干制備而得，經中國科學院微生物研究所鑒定為凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)。

1.2 試驗魚及飼養管理

試驗用異育銀鯽幼魚由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南泉基地提供，采用循環流水控溫系統進行養殖。試驗前，先用基礎飼料馴養14 d。選擇健康、質量基本一致［初始體質量為 (17.7±0.07)g］的異育銀鯽，隨機分為4組，每組3次重復，每個重復30尾魚。試驗期間，每天投喂2次(8∶00至8∶30，15∶30至16∶00)，直至表觀飽食為止，日投餌量為魚體質量的3% ～4%，并且根據生長和攝食的情況作適當調整。養殖期間水溫為24.5℃左右，pH 7.6～7.8，溶氧大于5 mg/L，氨態氮小于0.01 mg/L。試驗周期為42 d。

1.3 日糧

對照組飼喂的基礎日糧為鯽魚商品料(表1)，由通威公司提供。試驗日糧為基礎日糧分別添加質量分數為0.1%、0.3%、0.5% 凝結芽孢桿菌制劑(菌濃度為5.0×108CFU/g)。

表1 異育銀鯽基礎日糧Table 1 The basal diet of Carassius gibelio

1.4 樣品采集

采樣前禁食24 h，每次采樣于上午8∶00開始，環境溫度控制在26℃左右，每個桶隨機選取3尾魚，每組9尾異育銀鯽幼魚，每次采樣都是在同等條件下進行。將幼魚迅速撈起，尾靜脈采血，每尾魚的血液均分為2份，一份血液加入抗凝管中，24 h內進行血細胞測定，另一份血液于4℃條件下10 000 r/min離心5 min，制備得到的血清于-20℃凍存備用。采完血后的魚稱質量、量體長，并且剖開腹部，剝離出肝臟稱質量。

1.5 測定方法

1.5.1 血液常規參數的測定 白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)數量及血紅蛋白(HGB)濃度在深圳邁瑞全自動五分類動物血液細胞分析儀(BC-5300 VEt)上測定，試劑購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.5.2 血液生化指標的測定 血糖(Glu)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白質(TP)含量和谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性均在深圳邁瑞全自動生化分析儀(BS-400)上測定，試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.5.3 肝臟抗氧化指標的測定 肝臟樣品解凍后，用4℃生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干，稱質量。將樣品與生理鹽水按1︰9的比例在冰浴中勻漿，制成10%勻漿液。勻漿液在4℃、3 000 r/min條件下離心10 min，上清液保存于-80℃冰箱中。肝臟上清液蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定。過氧化物酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)分別采用嘌呤氧化酶法、紫外比色法、氧化還原法比色法、WST-1法測定，測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。測定方法參照試劑盒說明書。

1.6 生長性能相關指標的計算

按照下列公式［6］計算異育銀鯽幼魚生長性能相關指標:增質量率WGR=100×(Wt-W0)/W0，特定生長率SGR=100×(lnWt-lnW0)/t，餌料系數FCR=FI/(Wt-W0)，成活率SR=100×Nt/N0，肝體比HSI=100 × Wh/Wb，肥滿度CF=100×Wb/L3，式中，W0為試驗開始時魚平均體質量，Wt為結束時平均體質量，t為飼喂天數，FI為每尾魚平均攝食飼料總質量(風干樣)，Nt為收獲尾數，N0為放養尾數，Wh為結束時每尾魚肝臟質量，Wb為結束時每尾魚體質量，L為結束時每尾魚體長。

1.7 數據統計與分析

采用SPSS(Ver.11.5)軟件Duncan’s多重比較檢驗各組間的差異。

2 結果與分析

2.1 日糧中不同含量凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，在基礎日糧中添加0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌能夠顯著提高魚體的增質量率、特定增長率(P＜0.05)，并能夠顯著降低餌料系數(P＜0.05)，存活率、肝體比、肥滿度與對照組相比均無顯著差異(P＞0.05)。基礎日糧中添加0.1%凝結芽孢桿菌的試驗組與對照組相比各指標間均無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 日糧中不同含量凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚血液常規指標的影響

試驗結果(表3)顯示，各組之間白細胞和紅細胞數量及血紅蛋白濃度無顯著差異(P＞0.05)。

表2 日糧中不同含量凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚生長性能的影響Table 2 Effect of various B.coagulans levels on growth performance of juvenile C.gibelio

表3 日糧中不同含量凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚血常規參數的影響Table 3 Effect of various B.coagulans levels on blood parameters of juvenile C.gibelio

2.3 日糧中不同含量凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚血清生化指標的影響

試驗至第14 d，添加0.5%凝結芽孢桿菌試驗組堿性磷酸酶(ALP)活性和總蛋白質(TP)含量均顯著低于添加0.1%和0.3%凝結芽孢桿菌試驗組及對照組(P＜0.05)，第28 d時各試驗組及對照組之間ALP活性和TP含量均無顯著差異(P＞0.05);至第42 d時添加0.5%凝結芽孢桿菌試驗組血清中ALP活性和TP含量均顯著高于0.1%、0.3%凝結芽孢桿菌試驗組及對照組(P＜0.05)，而添加0.1%、0.3%凝結芽孢桿菌試驗組ALP活性和TP含量與對照組無顯著差異(P＞0.05)(表4)。

表4 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽血清生化指標的影響Table 4 Effect of B.coagulans on serum biochemical indexes of juvenile C.gibelio

與對照組相比，在飼料中添加0.1%、0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌制劑試驗組異育銀鯽幼魚血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)含量均無顯著差異(P＞0.05)，其中血清中GLU含量隨著養殖時間的延長呈現不斷上升的趨勢。

試驗前期(14 d)及中期(28 d)，各試驗組及對照組之間異育銀鯽幼魚血清中谷草轉氨酶(AST)活性、谷丙轉氨酶(ALT)活性無顯著差異(P＞0.05)。至第42 d，0.5%凝結芽孢桿菌制劑試驗組魚體中AST活性顯著高于0.1%、0.3%凝結芽孢桿菌制劑試驗組及對照組(P＜0.05)，而0.3%凝結芽孢桿菌制劑試驗組魚體中谷丙轉氨酶(ALT)活性顯著低于0.1%、0.5%凝結芽孢桿菌制劑試驗組及對照組(P＜0.05)。

2.4 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚肝臟抗氧化指標的影響

試驗至42 d，添加0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌試驗組魚體總抗氧化能力(T-AOC)顯著高于第14 d、第28 d魚體T-AOC(P＜0.05)。與對照組相比，試驗前期、中期各試驗組T-AOC與對照均無顯著差異(P＞0.05)，至后期，添加0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌的試驗組T-AOC顯著高于對照組與添加0.1%凝結芽孢桿菌試驗組(P＜0.05)，添加0.1%凝結芽孢桿菌試驗組T-AOC與對照組無顯著差異(P＞0.05)(圖1)。

圖1 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚總抗氧化能力(T-AOC)的影響Fig.1 Effects of B.coagulans on total antioxidant capacity(TAOC)of juvenile C.gibelio

第42 d，添加0.1%、0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌試驗組以及對照組魚體超氧化物歧化酶(SOD)活性均顯著高于第14 d、第28 d(P＜0.05)，呈現不斷升高的趨勢。與對照組相比，試驗前期、中期，各試驗組及對照組間SOD活性均無顯著差異(P＞0.05)。至42 d，添加0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌的試驗組SOD活性均顯著高于對照組(P＜0.01);添加0.1%凝結芽孢桿菌試驗組SOD活性與對照組間無顯著差異(P＞0.05)(圖2)。

圖2 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.2 Effects of B.coagulans on superoxide dismutase(SOD)activity of juvenile C.gibelio

第42 d，添加0.1%、0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌試驗組過氧化氫酶(CAT)活性較第14 d、第28 d均顯著提高(P＜0.05)，對照組CAT活性無顯著變化(P＞0.05)(圖3)。第14 d時，各試驗組與對照組無顯著差異(P＞0.05)，但至試驗中、后期，添加0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌試驗組CAT活性均顯著高于0.1%凝結芽孢桿菌試驗組和對照組(P＜0.05)。試驗后期，飼料中添加0.1%凝結芽孢桿菌試驗組CAT活性顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖3 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig.3 Effects of B.coagulans on catalase(CAT)activity of juvenile C.gibelio

在試驗過程中，0.1%凝結芽孢桿菌試驗組和對照組丙二醛(MDA)含量呈現逐漸上升的趨勢。0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌試驗組MDA含量均顯著低于對照組(P＜0.05)，且兩組間無顯著差異(P＞0.05)(圖4)。試驗前期、中期，0.1%凝結芽孢桿菌試驗組MDA含量與0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌試驗組無顯著差異(P＞0.05)，但第42 d時，0.1%凝結芽孢桿菌試驗組MDA含量顯著高于另外兩組(P＜0.05)，但顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖4 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚丙二醛(MDA)含量的影響Fig.4 Effects of B.coagulans on malonaldehyde(MDA)content of juvenile C.gibelio

3 討論

3.1 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚生長的影響

益生菌菌體含有豐富的蛋白質，可作為蛋白質源餌料或飼料添加劑。益生菌可在水產動物腸道內定殖，同時產生多種營養物質，參與水產動物的新陳代謝，有利于水產動物的生長。潘康成等［7］發現在鯉魚飼料中添加0.1%的芽孢桿菌，對鯉魚生長具有明顯的促進作用。慈麗寧等［8］在團頭魴基礎日糧中添加乳酸芽孢桿菌(M.amblycephala)，結果表明與對照組相比，添加乳酸芽孢顯著提高了魚體增質量率、蛋白質效率、特定生長率。

本試驗結果表明，與對照相比，飼料中添加0.3%和0.5%的凝結芽孢桿菌均能顯著提高魚體的增質量率、特定增長率，顯著降低餌料系數，這可能是由于飼料中添加的凝結芽孢桿菌能夠在腸道內分泌脂肪酶、蛋白酶等多種消化酶類，促進異育銀鯽幼魚對飼料中營養成分的利用，進而加強了飼料的利用價值，促進異育銀鯽幼魚的生長。但飼料中添加0.1%的凝結芽孢桿菌對異育銀鯽的生長性能沒有顯著的促進作用，這說明在飼料中添加的凝結芽孢桿菌需要達到一定的量才能促進異育銀鯽的生長。因此，結合當前凝結芽孢桿菌微生態制劑及異育銀鯽的市場行情，在飼料中添加適宜濃度的凝結芽孢桿菌可降低養殖成本，促進養殖戶增產增收。

3.2 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚血液常規指標的影響

血液作為魚體內一個非常重要的組成成分，與魚類的機體代謝、營養狀況以及疾病等有著非常密切的關系。因此，血液常規指標的變化被廣泛地用來評價魚類的健康、營養以及對環境的適應狀況，是重要的生理、病理和毒理學指標［9-11］。

本試驗中，凝結芽孢桿菌試驗組異育銀鯽幼魚的紅細胞數量和血紅蛋白濃度與對照組相比均沒有顯著性差異，也沒有隨凝結芽孢桿菌在飼料中添加量的增加而發生變化，此結果與微生態制劑(EM)對建鯉(Cyprinus carpio var.Jiaon)［12］、大口黑鱸(Micropterus salmoides)及鯽魚(Carassius auratus)［13］血液指標影響的試驗中發現紅細胞數量及血紅蛋白濃度有增加的趨勢但沒有顯著性差異的結果一致。凝結芽孢桿菌不能促進異育銀鯽血液中血細胞和血紅蛋白的生成。試驗中異育銀鯽血液中白細胞數量沒有顯著變化，表明魚體處于健康狀態，凝結芽孢桿菌沒有致病性。

3.3 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚血液生化指標的影響

血清總蛋白主要由血清球蛋白和血清白蛋白構成，血清總蛋白含量高，說明動物營養狀況良好［14］。與對照組相比，飼料中添加0.5%凝結芽孢桿菌的試驗組魚體血清總蛋白含量顯著提高，添加0.1%、0.3%凝結芽孢桿菌試驗組與對照組之間差異不顯著。因此，在飼料中添加適量的凝結芽孢桿菌制劑能夠提高魚體的循環抗體水平，促進機體對蛋白質的吸收。

堿性磷酸酶(ALP)是生物體內普遍存在并參與生命活動的一種重要的代謝調控酶，在水產養殖中，水產動物正常生命活動受到動物自身ALP活性大小的影響［15］。本試驗中，試驗至第42 d，飼料中添加0.5%凝結芽孢桿菌的試驗組魚體ALP活性較第14 d時顯著提高，且活性遠高于添加0.1%、0.3%凝結芽孢桿菌試驗組與對照組，而添加0.1%、0.3%凝結芽孢桿菌試驗組和對照組ALP活性較第14 d時顯著降低。說明凝結芽孢桿菌在魚體中要達到一定的濃度才能對血清中的ALP活性產生影響，本試驗結果與慈麗寧等［7］的結果相似。

葡萄糖是機體所需能量的主要來源，許多研究結果表明其含量可以作為反映物理因子引起的壓力或污染物脅迫的指標［16］。本試驗中，試驗組和對照組魚體的血糖含量均明顯增加，但試驗組與對照組之間無顯著差異(P＞0.05)。說明魚體未受到外界壓力或者有毒物質的威脅，凝結芽孢桿菌對異育銀鯽的血糖無顯著影響。

膽固醇是動物體內的一種重要類酯，通過生物轉變，在動物生命代謝活動中發揮重要的作用［17］。甘油三酯也是動物體內一種重要成分，但血清中甘油三酯過高有可能影響魚類脂肪代謝進而形成營養性脂肪肝［18］。本試驗中，無論總膽固醇或甘油三酯含量，添加凝結芽孢桿菌試驗組與對照組相比，均無顯著差異(P＞0.05)。說明飼料中添加凝結芽孢桿菌沒有引起魚體脂肪代謝障礙，但同時也說明凝結芽孢桿菌不能促進異育銀鯽的脂肪代謝。

谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)是臨床上檢查肝功能是否正常的重要指標。試驗結果顯示，與對照組相比，飼料中添加0.5%凝結芽孢桿菌試驗組AST活性顯著高于添加0.1%、0.3%凝結芽孢桿菌試驗組和對照組(P＜0.05);0.3%凝結芽孢桿菌試驗組ALT活性顯著低于對照組和0.1%、0.5%凝結芽孢桿菌試驗組(P＜0.05)。說明飼料中添加適量的凝結芽孢桿菌對肝細胞能起到一定的保護作用，但添加過量會對肝細胞造成一定程度的損害，其原因有待進一步研究。

3.4 凝結芽孢桿菌對異育銀鯽幼魚肝臟抗氧化指標的影響

水生動物在新陳代謝過程中，活性氧自由基的產生和消除保持著一種動態平衡。過多的氧自由基會引起脂質過氧化反應［19］。丙二醛是脂質過氧化物的主要成分，具有很強的生物毒性［20］，其含量可間接反映細胞受損情況。超氧化物歧化酶具有很強的抗氧化防御功能，過氧化氫酶能催化H2O2生成水和氧氣，清除多余的自由基，減少脂質的過氧化損傷［21］。因此，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性能夠反映機體在環境脅迫下抗氧化系統的變化［22］。總抗氧化能力是近幾年廣泛應用于衡量機體抗氧化系統功能狀況的綜合性指標。沈文英等［23］在養殖水體中使用芽孢桿菌后，三角帆蚌血清中的總抗氧化能力和SOD活性均顯著升高。

本試驗中，與對照組相比，飼料中添加0.3%、0.5%凝結芽孢桿菌能夠顯著提高肝臟的總抗氧化能力、過氧化氫酶及超氧化物歧化酶活性，有效抑制丙二醛的生成。該結果與沈文英等［24］的飼料中添加枯草芽孢桿菌試驗結果相一致。相關研究結果表明芽孢桿菌和乳酸菌均具有清除機體羥自由基、提高CAT活性以及抗脂質過氧化的能力［25-26］。凝結芽孢桿菌兼具乳酸菌與芽孢桿菌的特點，其抗氧化作用可能有2個方面:一利用乳酸菌的特性，通過提高SOD活性和還原型谷胱甘肽(GSH)含量，促進機體的抗氧化作用;二利用芽孢桿菌的特性，通過分泌抗氧化酶或者作為激活劑促進機體分泌抗氧化酶，清除自由基，阻止脂質過氧化，抑制丙二醛的生成。因此，凝結芽孢桿菌作為一種新型的微生態制劑可有效提高水產動物的抗氧化功能，降低自由基對機體的損傷，預防和控制養殖過程中的病害發生和傳播。綜合本試驗結果，在異育銀鯽飼料中添加0.3%凝結芽孢桿菌較適宜。

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