鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II在大腸桿菌中的表達及免疫學鑒定

鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II在大腸桿菌中的表達及免疫學鑒定

趙冬敏，黃欣梅，劉宇卓，韓凱凱，楊婧，謝星星，劉曉燕，李銀

(江蘇省農業科學院獸醫研究所，農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京210014)

摘要：為了實現鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白(E蛋白)結構域II在大腸桿菌中的表達并對其進行免疫學鑒定，根據鵝坦布蘇病毒JS804株囊膜蛋白基因序列，利用人工合成法獲得鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II編碼基因并引入限制性酶切位點，片段大小為507 bp。將合成的基因片段克隆入pGEX-4t-1原核表達載體中，構建重組表達載體pGEX-EII并轉化至BL21(DE3)中。通過優化表達條件獲得重組蛋白質并進行免疫學鑒定。結果顯示，重組蛋白質分子量約為 4.4×10`4，Western-blot和間接免疫熒光檢測結果表明重組蛋白質具有良好的免疫原性。

關鍵詞：鵝坦布蘇病毒；囊膜蛋白；結構域II

doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2015.03.025

收稿日期：2014-11-11

基金項目：國家自然科學基金項目(31172345);江蘇省自然科學基金項目(BK2012376)；江蘇省農業科學院基本科研業務專項項目[ZX(15)4005]

作者簡介：趙冬敏(1982-)，女，山東兗州人，博士，副研究員，主要從事家禽重大疫病流行病學和致病分子機制研究。(Tel)025-84390047；(E-mail)zhaodongmin126@126.com

通訊作者：李銀，(E-mail)muziyin08@163.com

中圖分類號：S858.322.5`+2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440(2015)03-0619-05

Abstract：To express and immunoidentify goose tembusu virus envelope domain II in Escherichia coli, the encoding gene of goose tembusu virus JS804 strain envelope protein domain II was artificially synthesized with the length of 507 bp. The synthesized gene was then inserted into the prokaryotic vector pGEX-4t-1 for the construction of recombinant expression plasmid pGEX-EII and then transformed into E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein with the molecular mass of 4.4×10`4 was successfully expressed in E. coli by optimizing the conditions of expression. Western-blot and IFA revealed the good immunogenicity exhibited by the recombinant protein.

Expression and immunology of domain II of goose tembusu virus envelope protein inEscherichiacoli

ZHAO Dong-min,HUANG Xin-mei,LIU Yu-zhuo,HAN Kai-kai,YANG Jing,XIE Xing-xing,LIU Xiao-yan,LI Yin

(InstituteofVeterinaryMedicine,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalsEngineeringandTechnology,MinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products,Nanjing210014,China)

Key words： goose tembusu virus；envelope protein;domain II

鵝坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬成員。水禽感染該病毒后，其臨床病癥為卵泡出血、萎縮、變性及瘢痕化，部分出現腦膜出血，食欲急劇減退、產蛋量驟降，群內發病率高達100%，死亡率為 5%～28%[1-3]。鴨鵝坦布蘇病毒自2010年暴發以來，已連年在中國多省大面積流行，并且感染的宿主譜還在不斷擴大，蛋鴨、種鴨、雛鴨、蛋鵝、種鵝及蛋雞等均出現坦布蘇病毒感染的病例[4-6]。該病毒病已成為危害中國鴨鵝養殖業的重要疫病之一。

鵝坦布蘇病毒基因組為單股正鏈RNA，基因組全長約為11 kb，包含1個開放閱讀框架(ORF)，編碼1個多聚蛋白質。囊膜蛋白(E蛋白)是黃病毒主要的結構蛋白，由約500個氨基酸殘基組成，分子量約為 5.5×104～ 6.0×104，2個囊膜蛋白單體分子以反向平行方式構成同源二聚體，90個E蛋白同源二聚體排列于成熟病毒顆粒的表面[7-8]。囊膜蛋白在病毒吸附,與宿主細胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要作用。同時，囊膜蛋白也是黃病毒主要的病毒抗原，含有多種抗原表位，可通過誘發中和抗體產生保護性免疫應答。囊膜蛋白屬于II型跨膜蛋白，X射線晶體學闡明，囊膜蛋白的晶體結構中，β-折疊占絕大多數，在空間上形成3個不同的結構域：結構域I、II和III(DI、DII和DIII)。囊膜蛋白結構域II由2個不連續片段組成，折疊成指樣結構(Finger-like structure)。該區域cd環富含甘氨酸且完全疏水，在幾乎所有的黃病毒屬病毒中均是保守的，它對病毒的融合活性非常重要，定點突變試驗已證實它可在囊膜蛋白由二聚體向三聚體轉變的過程中插入胞膜，參與病毒與宿主細胞膜融合，被認為是病毒的融合多肽(Fusion peptide)。I和II區界面存在1個分子鉸鏈區，該區可通過酸性pH介導的構象變化使融合多肽移向宿主細胞膜，并形成融合多肽的突出部分[10-11]。

由于黃病毒屬坦布蘇病毒引起的疫病是新發疫病，目前尚未見有關鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II的研究報道。本研究通過人工合成法合成鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II的編碼基因并克隆入表達載體pGEX-4t-1中，利用大腸桿菌表達系統表達重組囊膜蛋白質結構域II并對其進行免疫學鑒定，為進一步研究鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構和功能及研制亞單位疫苗打下基礎。

1材料與方法

1.1　試驗材料

鵝坦布蘇病毒JS804株囊膜蛋白結構域II基因核苷酸片段由南京金斯瑞生物有限公司合成。pGEX-4t-1原核表達載體、宿主菌BL21(DE3)、E蛋白陽性血清，均由江蘇省農業科學院獸醫研究所家禽重大疫病防控項目組保存。

1.2　主要試劑

瓊脂糖凝膠回收試劑盒、小量提取質粒試劑盒等購自Axygen公司；T4 DNA連接酶、限制性內切酶、DNA marker等購自大連寶生物有限公司；GST抗體、堿性磷酸酯酶標記山羊抗小鼠IgG、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術研究所；其他試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.3　鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II基因片段的合成

根據GenBank中登錄的鵝坦布蘇病毒JS804株(登錄號：JF895923)E基因序列，由南京金斯瑞生物有限公司人工合成結構域II基因片段并分別在5′和3′端加入EcoR I(GAATTC)和SalI(GTCGAC)酶切位點，片段全長為507 bp。

1.4　重組表達質粒的構建與鑒定

將合成的結構域II基因片段和pGEX-4t-1質粒分別用EcoRⅠ和SalI雙酶切。用T4 DNA連接酶將酶切后的結構域II基因與pGEX-4t-1載體連接，構建重組表達載體pGEX-EII，轉化BL21(DE3)感受態細胞。經酶切鑒定后，挑選陽性克隆質粒送南京金斯瑞生物有限公司進行基因序列測定，并進行序列分析。

1.5　結構域II蛋白的誘導表達與SDS-PAGE分析

取含重組質粒pGEX-EII的陽性BL21(DE3)菌液，接種于5 ml含有氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB液體培養基中，37 ℃培養過夜。次日取100 μl接種于10 ml含有氨芐霉素(100 μg/ml)的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600值達 0.3～0.4。以終濃度1 mmol/L IPTG誘導表達，分別于誘導后0 h、3 h、4 h、5 h取500 μl菌液，12 000r/min離心5 min，棄上清液。沉淀用生理鹽水重懸后與4×蛋白質電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，以pGEX-4t-1空載體進行同樣的操作為對照，進行SDS-PAGE蛋白質電泳觀察結果。

1.6　重組結構域II蛋白在菌體中的分布分析

取5 ml 1 mmol/L IPTG誘導5 h的菌液，12 000r/min離心5 min，棄上清液。沉淀用3 ml菌體裂解液重懸，超聲波破碎15 min，12 000r/min離心5 min。分別取上清液和沉淀與4×蛋白質電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，進行SDS-PAGE蛋白質電泳觀察結果，以確定表達蛋白質存在的位置。

1.7　重組蛋白質的Western-blot鑒定

重組蛋白質經12%SDS-PAGE分離后，采用濕法將蛋白質轉印至硝酸纖維膜(NC)上，采用70 V電壓，作用1 h。5% BSA、37 ℃封閉2 h，TBST(0.05% Tween-20)洗滌后分別加入GST標簽單抗和E蛋白陽性血清并于4 ℃過夜。TBST(0.05% Tween-20)洗滌后加入堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗鼠IgG于37 ℃孵育1 h。TBST(0.05% Tween-20)洗滌后按照BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒說明書顯色。

1.8　鼠抗重組蛋白質血清的制備及其效價的測定

將純化的重組蛋白質與等量弗氏完全佐劑混合并充分乳化后皮下多點免疫BALB/c小鼠，每只免疫重組蛋白質的劑量為70 μg，免疫后7 d采集血清。以純化的重組蛋白質包被ELISA板，PBST洗滌3次后每孔加入100 μl梯度稀釋的小鼠血清，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌后每孔加1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG二抗100 μl，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次，加 入TMB底物避光顯色10 min。以2 mol/L H2SO4終止反應，450 nm波長下讀取OD450值。

1.9　間接免疫熒光(IFA)鑒定

利用鵝坦布蘇病毒JS804株感染BHK-21細胞，感染后4 d棄去培養上清，用無水乙醇固定，加入 1∶50稀釋的鼠抗重組蛋白質血清，37 ℃孵育1 h。PBST洗3次，加入 1∶200稀釋的 FITC 標記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h。PBST洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察并記錄結果，以正常BHK-21細胞作對照。

2結果

2.1　鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II基因的獲得

利用EcoR I和SalI雙酶切含有結構域II人工合成基因的質粒pUC57-simple-EII，獲得大小約為507 bp的片段，與預期大小相符(圖1)。

M：DL2000 marker；1：結構域II基因片段。 圖1　人工合成結構域II基因片段 Fig.1　Synthetic domain II gene fragment

2.2　鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II重組表達質粒的構建

提取重組質粒pGEX-EII，限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到2個片段，大小與預期相符(圖2)。測序結果表明結構域II片段以正確方式插入pGEX-4t-1載體中且序列正確。

1：重組質粒pGEX-EII Eco RⅠ和SalⅠ酶切；M：DL2000 marker。 圖2　重組質粒pGEX-EII的酶切鑒定 Fig.2　Identification of recombinant plasmid pGEX-EII by enzyme digestion

2.3　鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II的誘導表達與SDS-PAGE分析

將鑒定為陽性的細菌進行IPTG誘導表達。經SDS-PAGE檢測后發現，以1 mmol/L IPTG誘導時，pGEX-EII在誘導后4 h出現目的條帶，大小約為 4.4×104的融合蛋白質，與預期蛋白質大小一致，在誘導4 h時表達量最高(圖3)。

1：蛋白質分子量marker；2：pGEX空載體；3～6：誘導后0 h、3 h、4 h、5 h表達的蛋白質。 圖3　pGEX- EII重組蛋白質的SDS-PAGE檢測 Fig.3　Analysis of pGEX-EII fusion protein by SDS-PAGE

2.4　重組鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II在菌體中的分布

將誘導表達5 h的細菌進行超聲波裂解，經SDS-PAGE電泳分析，發現pGEX-EII融合蛋白質以包涵體形式存在(圖4)。

1：超聲裂解后沉淀；2：超聲裂解后上清液；3：蛋白質分子量marker。 圖4　pGEX-EII重組蛋白質在菌體中的分布 Fig.4　Distribution of pGEX-EII fusion protein in recombinant E. coli

2.5　重組鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II的Western-blot鑒定

分別利用GST單抗和囊膜蛋白陽性血清Western blot檢測重組結構域II蛋白，結果顯示GST單抗和E蛋白陽性血清均檢測到特異性條帶，表明重組結構域II蛋白具有良好的免疫原性(圖5、圖6)。

1：重組結構域II蛋白；2：蛋白質分子量marker。 圖5　GST單克隆抗體鑒定pGEX-EII表達的融合蛋白 Fig.5　Western-blot identification of pGEX-EII fusion protein with GST McAb

1：蛋白質分子量marker；2：重組結構域II蛋白。 圖6　E蛋白陽性血清鑒定pGEX-EII融合蛋白 Fig.6　Western-blot identification of pGEX-EII fusion protein with positive serum for E protein

2.6　鼠抗重組蛋白質血清的制備及其效價的測定

用純化的重組蛋白質免疫小鼠獲得抗血清后，利用間接ELISA方法檢測血清效價。將純化的重組蛋白質包被ELISA板，以獲得的小鼠抗血清作為一抗。結果顯示，免疫后7 d，抗體效價可達 1∶800，表明利用大腸桿菌表達的E蛋白結構域II具有良好的免疫原性，免疫后可誘導機體產生特異性免疫應答。

2.7　間接免疫熒光(IFA)鑒定

用大腸桿菌表達的重組蛋白質免疫小鼠獲得抗血清后，利用間接免疫熒光對該血清進行鑒定。結果顯示，獲得的血清可與鵝坦布蘇病毒JS804株發生特異性結合，表明該血清具有較好的特異性(圖7)。

A：未感染的空白BHK-21細胞；B：鵝坦布蘇病毒JS804株感染的BHK-21細胞。 圖7　抗血清的間接免疫熒光鑒定 Fig.7　Indirect immunofluorescence analysis of the murine anti-serum

3討論

2010年4月以來，福建、河北、浙江、山東、江蘇、北京等省市的鴨鵝陸續暴發了一種以食欲急劇減退、產蛋量驟降為主要特征的新發疫病，給鴨鵝養殖業造成了重大經濟損失。研究者通過病原分離和系統的實驗室診斷，確定該病由黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病毒感染引起[12-13]。

黃病毒屬病毒囊膜蛋白結構域II內的cd環是病毒的融合多肽，參與病毒與宿主細胞膜融合。研究結果表明，該區某些位點的突變可通過破壞病毒與宿主細胞膜融合而影響病毒的神經毒力。結構域II末端與莖干區相接觸的b、d和j鏈，以及bc環上的氨基酸突變均可直接破壞囊膜蛋白外側與prM和(或)其他囊膜蛋白單聚體之間的作用，并選擇性地改變結構域II頂端的構象，干擾融合多肽的出現。因此，黃病毒屬病毒囊膜蛋白結構域II與病毒的致病性密切相關[14-15]。深入研究鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II將有助于開發基于囊膜蛋白的新型疫苗和特異性藥物，為鵝坦布蘇病毒病的防控以及抗病毒藥物的設計提供理論基礎。

本研究通過基因合成的方法獲得編碼鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II的基因片段，將其插入原核表達載體pGEX-4t-1中，構建了重組質粒pGEX-EII，并在大腸桿菌中成功表達了鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構域II。Western blot鑒定結果表明，該蛋白質可與E蛋白陽性血清和GST標簽單克隆抗體發生特異性反應。利用純化后的重組蛋白質免疫小鼠，免疫后7 d抗血清效價可達 1∶800。間接免疫熒光試驗檢測結果表明，該血清可與感染BHK-21細胞的鵝坦布蘇病毒發生特異性反應，表明重組蛋白質具有良好的免疫原性。

由于鵝坦布蘇病毒感染在中國主要鵝養殖地區廣泛存在，嚴重危害鵝養殖業的健康發展，因此，有效預防及控制鵝坦布蘇病毒病的發生和流行越來越受到人們的重視。本研究為進一步深入研究鵝坦布蘇病毒囊膜蛋白結構和功能奠定了基礎，此外該重組蛋白質也可作為鵝坦布蘇病毒亞單位疫苗的候選疫苗，進行疫苗保護性研究。

參考文獻：

[1]HUANG X, HAN K, ZHAO D, et al. Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from geese in China. Res Vet Sci, 2013, 94(3): 774-780.

[2]SU J, LI S, HU X, et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus, a new tembusu-related flavivirus . PLoS One, 2011, 6 (3): 1-10.

[3]YAN P, ZHAO Y, ZHANG X, et al. An infectious disease of ducks caused by a newly emerged tembusu virus strain in mainland China . Virology, 2011, 417(1): 1-8.

[4]陳仕龍,陳少鶯,王劭,等. 一種引起蛋雞產蛋下降的新型黃病毒的分離與初步鑒定. 福建農業學報, 2011, 26 (2): 170-174.

[5]傅光華,黃瑜,施少華,等. 雞黃病毒的分離與初步鑒定. 福建畜牧獸醫, 2011, 33 (3): 1-2.

[6]李玉峰,馬秀麗,于可響,等. 一種從鴨新分離的黃病毒研究初報. 畜牧獸醫學報, 2011, 42(6): 885-891.

[7]ALCON S, TALARMIN A, DEBRUYNE M, et al. Enzyme-linked immunosorbent assay specific to dengue virus type 1 nonstructural protein NS1 reveals circulation of the antigen in the blood during the acute phase of disease in patients experiencing primary or secondary infections . J Clin Microbiol, 2002, 40 (2):376-381.

[8]ALCON-LEPODER S, SIVARD P, DROUET M T, et al. Secretion of flaviviral non-structural protein NS1: from diagnosis to pathogenesis . Novartis Found Symp, 2006, 277: 233-247.

[9]鄧永強,秦鄂德. 蟲媒黃病毒包膜E蛋白的研究進展 . 軍事醫學科學院院刊, 2006, 30 (6): 575-579.

[10]STIASNY K, BRESSANELLI S, LEPAULT J, et al. Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation . Embo J, 2004, 23(4): 728-738.

[11]李焱,時瑩,徐志凱,等. 登革病毒E蛋白入胞機制研究現狀. 熱帶醫學雜志, 2010, 10 (2): 221-222.

[12]黃欣梅,李銀,趙冬敏,等. 新型鵝黃病毒JS804毒株的分離與鑒定. 江蘇農業學報, 2011, 27(2): 354-360.

[13]蘇敬良. 鴨的新型黃病毒BYD引起的產蛋下降綜合征. 獸醫導刊, 2011(4): 27-29.

[14]PLETNEV A G, BRAY M, HANLEY K A, et al. Tick-borne Langat/mos-quito-borne dengue flavivirus chimera, a candidate live attenuated vaccine for protection against disease caused by members of the tick-borne encephalitis virus complex: evaluation in rhesus monkeys and inmosquitoes . J Virol, 2001, 75(17):8259 -8267.

[15]LI J, BHUVANAKANTHAM R, HOWE J, et al. The glycosylation site in the envelope protein of WestNile virus (Sarafend) plays an important role in replication andmaturation processes . J Gen Virol, 2006, 87(3): 613-622.

(責任編輯：張震林)

李保全，申愛華，周蔚，等. 米糠毛油對肉豬生產性能、脂類代謝及相關基因表達的影響[J].江蘇農業學報，2015，31(3)：624-629.