傅里葉變換紅外光譜結合判別分析法診斷蠶豆病蟲害

劉 飛， 楊春艷， 謝建新

(1.玉溪師范學院物理系，云南 玉溪 653100;2.玉溪師范學院化學系，云南 玉溪 653100)

蠶豆是中國重要的冷季作物，具有蛋白質含量高、易消化吸收、用途廣以及深加工增值的特點，是典型的糧、菜、飼兼用型作物，具有較高經濟價值［1-2］。蠶豆的產量和品質受生產過程中生物和非生物脅迫因素的影響。生物脅迫因素包括真菌、細菌、病毒等病原物引起的病害以及農業害蟲造成的蟲害［3］。在農業生產中，作物病蟲害防治措施不恰當與隨意使用農藥現象普遍存在，這影響了作物產品質量，與國家發展綠色農業、高效農業、精細農業的目標不相符。其主要原因在于不能正確鑒別病蟲害和判斷病蟲害的危害程度。及時診斷病蟲害，判斷病蟲害的危害程度，采取必要措施，進行有效防治，對提高蠶豆的產量和質量具有重要意義。

目前對于作物病蟲害的研究，主要包括通過農作物育種和田間管理減少病蟲害以及加強病蟲害監測兩方面［4］。農作物病蟲害監測主要通過田間采樣、生物學檢測和顯微鏡觀察等方法進行［5-6］。生物學檢測包括病原體分離、培養、接種鑒定等一系列過程;顯微鏡觀察需經過固定、染色等較為復雜的過程，且主觀性強，不能給出樣品的化學信息［5］。用于作物病蟲害鑒定的方法還有生理生化測定技術、免疫血清檢測技術、分子生物學手段等，這些方法同樣需要分離提取，且操作繁瑣，成本較高［6-7］。近紅外光譜、高光譜、多光譜成像技術已用于農作物病蟲害的田間診斷研究［8-9］，但易受天氣、作物覆蓋程度、田間土壤、雜草等影響，不同測量條件與環境獲得的檢測模型不同，需要提高模型的通用性和穩定性［10］。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)具有方便、快速、重復性好、取樣量少等特點，已經用于真菌與細菌菌株［11］、作物品種與產地［12］等方面的鑒別。在蠶豆病蟲害的研究方面，李志永等［13］通過FTIR光譜結合主成分分析研究鑒別了蠶豆不同病害。主成分分析中通過主成分得分圖進行分類鑒別，在病蟲害種類較多、樣品數量較大的情況下難于操作，需要在FTIR光譜的基礎上結合其他方法繼續研究。判別分析是多元統計分析中判斷個體所屬類型的應用性很強的統計方法［14］。FTIR光譜結合判別分析用于農產品分類鑒別已有報道［15-16］，但用于植物病蟲害診斷鑒別的研究未見報道。本研究用蠶豆病蟲害葉片樣品的FTIR光譜及其一階導數光譜和二階導數光譜，結合判別分析對蠶豆病蟲害種類和病原物類別進行診斷研究，同時比較挑選變量建立判別函數時不同方法的診斷效果，期望為蠶豆病蟲害的診斷提供新的簡便快捷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

測試樣品采自云南省陸良縣、宜良縣、富民縣、通海縣、新平縣和玉溪市等地，包括結莢期正常蠶豆葉片和結莢期11種蠶豆病蟲害葉片，共110個樣品;11種蠶豆病蟲害的病原物涉及真菌、細菌、病毒和蟲害等4種(表1)。樣品在自然條件下晾干待測。

表1 試驗樣品名稱及病原物類別Table 1 Name and category of pathogen of each sample

1.2 儀器與試劑

紅外光譜儀為PE公司生產的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀。采用 DTGS檢測器，光譜分辨率為4 cm-1，測量范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數為16次。試驗試劑溴化鉀，純度99.9%。

1.3 試驗方法和數據處理

取各樣品葉片的病斑部分放入瑪瑙研缽研磨成均勻細粉，再按1︰60的比例加入溴化鉀粉末攪磨均勻，然后壓片測試。每個葉片樣品壓制1個掃描片，測試紅外光譜，所有光譜都扣除背景，并在光譜軟件Omnic8.0中進行自動基線校正、九點平滑和歸一化等預處理。各樣品紅外光譜的一階導數光譜和二階導數光譜在Omnic8.0中計算。

判別分析使用SPSS V20.0軟件。以已知病蟲害類別樣品紅外光譜數據為判別指標，采用逐步判別法，選擇判別指標挑選方法，依據Fisher線性判別準則建立病蟲害類別的判別函數，進行樣品病蟲害的預測診斷。在SPSS V20.0的判別分析模塊中，判別指標挑選方法共設置有5種，即 Wilks’Lambda、Unexplained variance、Mahalanobis distance、Smallest F ratio和 Rao’s V。本研究中，事先將樣品分為訓練樣本和測試樣本，從病蟲害樣品中各抽取5個組成訓練樣本，共60個樣品。測試樣本由各種病蟲害樣品中余下的組成，共50個樣品。

2 結果與分析

2.1 蠶豆病蟲害葉片的紅外光譜特征

圖1為蠶豆正常葉片和病蟲害葉片樣品的紅外光譜圖。根據文獻［12］、［13］將光譜中主要的光譜峰歸納如下:光譜在波數3 400 cm-1附近的強寬峰為O-H和N-H的伸縮振動吸收;2 958 cm-1和2 876 cm-1附近的弱吸收峰是甲基的C-H反對稱和對稱伸縮振動;2 930 cm-1和2 853 cm-1附近的弱吸收峰是亞甲基的C-H反對稱和對稱伸縮振動;1 740 cm-1附近的弱吸收峰是脂類C=O的伸縮振動;1 644 cm-1附近的強吸收峰是酰胺Ⅰ帶C=O的伸縮振動;1 550 cm-1附近中等強度的吸收峰是酰胺Ⅱ帶N-H和C-N的吸收峰;1 440～1 330 cm-1主要為蛋白質、纖維素、木質素等受氧、氮原子影響的甲基和亞甲基對稱彎曲振動以及甲基的C-H剪式振動;1 280 cm-1附近出現的吸收峰是酰胺Ⅲ帶C-N的伸縮振動和N-H彎曲振動以及木質素中C-O伸縮振動的疊加;位于1 148 cm-1、1 102 cm-1和1 053 cm-1附近的階梯峰，主要歸屬為纖維素、木質素等多糖類物質C-O和CO-C 的伸縮振動;922 cm-1、670 cm-1、622 cm-1等弱峰為糖環或長鏈亞甲基中C-C的伸縮振動;836 cm-1附近的弱吸收峰為木質素中 C-H平面彎曲振動。上述光譜特征表明蠶豆葉片中主要含蛋白質類物質、纖維素和木質素等多糖類物質。

圖1 蠶豆正常葉片和病蟲害葉片樣品的紅外光譜圖Fig.1 FTⅠR spectra for healthy leaves and diseases and pestsinfected broad bean leaves

2.2 不同范圍的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析

分別選擇1 800～950 cm-1、1 800～1 200 cm-1、1 800～ 1 500 cm-1、1 500～ 1 200 cm-1和1 200～950 cm-15個不同范圍的測試樣品紅外光譜數據作為判別指標，按照逐步判別法，選用Wilks’Lambda方法挑選變量，依據Fisher線性判別準則建立病蟲害類別的判別函數，對樣品進行判別診斷。5個不同范圍的紅外光譜數據對蠶豆病蟲害種類的判別分析結果見表2。由表2可知，1 800～1 200 cm-1光譜范圍的數據所建立的判別函數對測試樣品的診斷效果相對較好，訓練樣本回判的正確率為98.3%，測試樣本預測的正確率為82.0%，總體判別正確率為90.9%。

表2 不同范圍的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析結果Table 2 Discriminant analysis of the category of diseases and pests of broad bean based on different range spectrum

2.3 不同級別的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析

分別以各樣品在1 800～1 200 cm-1的紅外光譜、一階導數紅外光譜和二階導數紅外光譜數據作為判別指標，按照逐步判別法，選用Wilks’Lambda方法挑選變量，依據Fisher線性判別準則建立病蟲害類別的判別函數對樣品進行判別診斷。3種級別的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析結果見表3。在表3中，一階導數紅外光譜數據所建立的判別函數對訓練樣本回判的正確率和對測試樣本預測的正確率以及總體判別正確率都最高，紅外光譜的次之，且判別正確率與一階導數紅外光譜的較接近，表明紅外光譜數據和一階導數光譜數據都適合作為蠶豆病蟲害診斷的判別指標。導數光譜能放大光譜特征，同時也會降低光譜的信噪比。不同病蟲害的蠶豆葉片中主要物質成分差異不大，光譜信息中反映不同病蟲害的信息相對較弱，導數光譜放大光譜特征的同時，也會降低甚至掩蓋不同病蟲害的光譜信息。因此，二階導數光譜數據作為判別指標所建立的判別函數，診斷效果較差。相對而言，3種級別的光譜數據中，一階導數光譜數據更適合于用作判別指標診斷蠶豆病蟲害。

表3 不同級別的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析結果Table 3 Discriminant analysis of the category of broad bean diseases and pests based on different level spectrum

2.4 不同判別指標挑選方法對病蟲害診斷效果的比較

以1 800～1 200 cm-1的一階導數光譜數據作為判別指標，采用逐步判別法，用不同方法挑選變量，按照Fisher線性判別準則分別建立判別函數，對樣品進行診斷比較。同時采用五折交叉驗證法檢驗不同方法所建立的判別函數的穩定性［17］。由表4可知，5種方法所建立的判別函數在5種訓練樣本情況下對訓練樣本的回判正確率都是100%，但對測試樣本的預測正確率差異明顯。選擇Unexplained variance方法時，預測正確率最高，為84.8%;選擇Wilks’lambda方法時，預測正確率次高，為80.0%;選擇Mahalanobis distance方法時，預測正確率最低，為73.2%。同種方法在五折交叉驗證的不同訓練樣本情況下，對測試樣本的預測正確率差異，反映了這種方法所建立的判別函數的穩定性。選擇Wilks’lambda方法時，5種訓練樣本情況下對測試樣本的預測正確率差異相對最小，說明 Wilks’lambda方法所建立的判別函數相對最穩定。綜合不同方法在5種訓練樣本情況下對測試樣本預測的平均正確率、最高正確率和最低正確率考慮，在用基于一階導數紅外光譜數據的判別分析方法對蠶豆病蟲害進行診斷時，選用Unexplained variance逐步判 別法最合適，其次為Wilks’lambda逐步判別法。

表4 挑選判別指標不同方法對蠶豆病蟲害種類的判別分析結果Table 4 Discriminant analysis of the category of broad bean diseases and pests based on ways to choose discriminant indexes

2.5 一階導數光譜結合判別分析對蠶豆病蟲害病原物類別的診斷

以樣品在1 800～1 200 cm-1的一階導數紅外光譜數據作為判別指標，每種病蟲害選擇5個樣品作為訓練樣本，其余樣品作為測試樣本，采用逐步判別法，判別指標挑選方法分別選擇Unexplained variance和 Wilks’lambda，按照Fisher線性判別準則建立病蟲害病原物類別判別函數，對樣品病蟲害病原物類別進行診斷，結果見表5。采用Unexplained variance方法時，訓練樣本回判正確率為100%，測試樣本預測正確率為70.0%，總正確率為86.4%;采用Wilks’lambda方法時，訓練樣本回判正確率為98.3%，測試樣本預測正確率為84.0%，總正確率為91.8%。說明通過樣品的一階導數紅外光譜數據結合判別分析方法能鑒別蠶豆病蟲害的病原物類別，Wilks’lambda逐步判別法診斷效果相對較好。

表5 一階導數紅外光譜對蠶豆病蟲害病原物類別的判別分析結果Table 5 Discriminant analysis of the category the of pathogen of broad bean diseases and pests based on first derivative spectrum

3 討論

利用FTIR光譜技術測試了結莢期蠶豆正常葉片和11種蠶豆病蟲害葉片共110個樣品的紅外光譜，通過光譜軟件Omnic8.0計算了各樣品的一階導數紅外光譜和二階導數紅外光譜。以紅外光譜數據為判別指標，按照逐步判別法，依據Fisher線性判別準則對蠶豆病蟲害種類進行診斷研究，比較了5個不同光譜范圍、3種級別光譜、5種判別指標挑選方法所建立的判別函數的鑒別診斷效果，同時按照5折交叉驗證法檢驗了5種判別指標挑選方法的穩定性。結果表明，基于蠶豆病蟲害葉片的一階導數紅外光譜數據結合逐步判別分析法能較好診斷樣品的病蟲害種類和病原物類別，以1 800～1 200 cm-1的光譜數據為判別指標，采用Unexplained variance逐步判別法對病蟲害種類診斷時，正確率相對最高，為93.1%;采用Wilks’lambda逐步判別法對病原物類別診斷時，正確率為91.8%。FTIR光譜技術具有方便快捷的特點，與判別分析方法相結合，可為蠶豆病蟲害診斷提供一種簡便易行的方法。

逐步判別法是一種有監督的模糊識別統計方法，需要根據已經掌握的事物分類情況，對每個類別的若干樣本的特征指標，按照某種挑選指標的方法將樣本的變量信息逐一進行檢驗，篩選出對樣本分類影響較大的指標建立判別函數，進行分類鑒別。因此，使用逐步判別法來對事物進行分類鑒別時，必須事先掌握一批按事物特征分類的樣本。蠶豆病蟲害葉片的FTIR光譜是葉片物質組分信息的綜合反映，包含著品種、產地、栽培方式、病蟲害等信息。這些信息隱藏在樣品光譜中，相互交織，通過對大量樣品光譜的統計分析，可以挖掘出相關特征信息用以相關的識別。基于病蟲害危害葉片FTIR光譜進行病蟲害類別判別分析時，為了能建立好的判別模型，準確區分病蟲害類別，采集樣本量必須大，且同種病蟲害樣品覆蓋的品種和產地要多，用以建立判別函數的訓練樣本應盡量包含各品種和各產地的樣品。在SPSS V20.0判別分析模塊的判別輸出結果中，對待判樣品的分類判別輸出了2個結果，即最大可能判別結果和次大可能判別結果。本試驗的判別分析結果，都是按最大可能判別結果計算的。但我們注意到最大可能判別結果和次大可能判別結果相結合，能幫助提高待判樣品判別結果的相對準確性，縮小待判樣品分類所屬范圍。例如在本研究中以1 800～950 cm-1光譜數據作為判別指標，按照Wilks’lambda逐步判別法，依據Fisher線性判別準則建立病蟲害種類的判別函數對樣品進行診斷鑒別時，對測試樣本預測的最大可能判別結果中判別錯誤的有11個，預測正確率為78.0%，而在最大可能判別結果和次大可能判別結果中都判別錯誤的減少到3個，預測的相對正確率增加到96.0%。

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