水稻淀粉合成相關基因分子標記的篩選與利用

劉燕清， 強新濤， 趙春芳， 于 新， 姚 姝， 周麗慧， 陳 濤， 趙慶勇，朱 鎮， 張亞東， 王才林

(1.南京農業大學農學院/江蘇省現代作物生產協同創新中心，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農業科學院糧食作物研究所/江蘇省優質水稻工程技術研究中心/國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014)

淀粉是稻米胚乳中最主要的成分，占精米的90%，由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其中直連淀粉含量一直以來被認為是衡量稻米食味品質的最重要指標［1-3］。直鏈淀粉是由蠟質基因(Wx)編碼的顆粒結合淀粉合成酶(GBSS)催化而成的。支鏈淀粉由可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)以及淀粉去分支酶(DBE)等協同合成。在淀粉合成途徑中已報道了20多個相關基因參與編碼這些酶類，包括編碼ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大小亞基的AGPlar、AGPis、AGPsma基因及由不同剪接方式產生的多個基因，編碼淀粉合成酶的基因 Wx、GBSSII、SSI、SSIIa、SSIIb、SSIIc、SSIIIa、SSIIIb、SSIVa、SSIVb，編碼淀粉去分支酶的基因SBE1、SBE3、SBE4以及編碼去分支酶的ISA、PUL基因等［4-6］。近年來有學者認為淀粉磷酸化酶和歧化酶也參與了淀粉合成，其編碼基因有PHO1、PHO2和DPE等［7］。面對如此眾多的參與淀粉合成的調控基因，要研究它們對稻米食味品質的遺傳效應，應該首先明確它們在基因組水平上的基因型差異。

淀粉合成相關基因在水稻種質資源中存在著豐富的自然變異這些等位變異決定了稻米品質性狀的多樣性表現，在大量資源中挖掘淀粉合成相關基因的優異等位變異是品質性狀育種改良的重要研究內容［8］。目前，國內已經對淀粉合成相關基因進行了序列分析，并設計了有效的基因型檢測分子標記。謝會蘭［9］對13個品質性狀上有差異的水稻品種中的18個淀粉合成相關基因進行了測序，在基因序列上的InDel及SNP特異位點處有選擇地進行標記設計，研究了這些標記在復等位基因研究方面的應用潛力。李剛［10］基于水稻秈粳亞種數據庫比對，開發了淀粉合成相關基因的15個分子標記，根據各基因標記所劃分的基因型來分析非糯材料淀粉理化特征值的差異。田志喜等［11］通過分析16個典型水稻品種的淀粉合成相關基因的全基因序列，明確了各基因在不同種質中的等位變異，設計了51個可以區分不同等位基因變異的分子標記。

本研究盡可能多地收集了當前文獻資料中的淀粉合成相關基因的分子標記，在不同水稻品種中進行了多態性篩選，并利用篩選到的差異等位基因標記，在粳稻育種后代品系中進行基因型鑒定，為分析淀粉合成相關基因的遺傳效應奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

包括3組水稻品種(系)，第一組為17份不同水稻品種，包括6個秈稻品種、8個粳稻品種和3個糯稻品種;第二組為28份粳稻親本，主要為全國各省的主栽品種;第三組為來源于關東194/武粳13組合后代的88份穩定品系。

供試材料于2013年5月～10月種植在江蘇省農業科學院糧食作物研究所試驗田。5月10日播種，6月10日移栽，常規管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 移栽后30 d取幼嫩葉片，采用 CTAB 法［12］提取 DNA。

1.2.2 淀粉合成相關基因分子標記引物設計 利用文獻報道的淀粉合成途徑中的調控基因及所用到的分子標記信息［13-15］，由上海英俊生物科技有限公司合成分子標記檢測引物，共合成了83對引物，包括STS和CAPS標記。

1.2.3 DNA片段擴增與酶切 PCR反應在Eppendorf-5330 PCR 儀上擴增，總體積 10.00 μl，其中dd H2O 6.55 μl，10 × Buffer 1.00 μl，dNTP 0.20 μl，Taq DNA 聚合酶 0.50 μl，上、下游引物各 1.00 μl，模板DNA 1.00 μl。PCR擴增采用94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共33個循環。酶切體系:PCR擴增產物10.00 μl，內切酶 1.00 μl，10 × Buffer 2.00 μl，0.1%BSA 2.00 μl，dd H2O 5.00 μl。酶切時間為 1 h。產物用1.5%的瓊脂糖凝膠或者9.0%的聚丙烯酰胺電泳檢測。試驗中所用內切酶均購于TaKaRa公司。

1.2.4 聚類分析 PCR擴增產物根據擴增帶的有無按1、0統計建立數據矩陣。在相同遷移位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”。每2份材料間的遺傳差異按Nei等［16］的方法計算遺傳相似性系數和遺傳距離。根據所得遺傳相似系數，利用 NTSYS-pc Version 2.0 軟件［17］，用其中的 UPGMA方法進行遺傳相似性聚類。

2 結果與分析

2.1 淀粉合成相關基因分子標記在秈粳亞種間的多態性

利用文獻報道的淀粉合成相關基因的83個分子標記［13-15］，對6個秈稻品種、8個粳稻品種和3個糯稻品種進行等位基因多態性檢測。83個標記中60個能夠進行很好的PCR擴增，其中48個具有多態性，多態率為80%。利用48個多態性標記的分子數據，計算17個水稻品種的遺傳相似性系數，其范圍在0.88～1.00。以遺傳相似性系數0.97為閾值，進行UPGMA聚類分析，得到17個品種的淀粉合成相關基因分子數據的聚類圖(圖1)。由圖1看出，供試材料被分成3大類:第I類為粳稻分支，包括所有粳稻品種和2個糯稻品種，其中武粳13的遺傳背景與其他粳稻或糯稻有明顯差異，其他粳稻或糯稻間的基因序列保守性很高;第II類包括2個秈稻品種(9311和明恢63)和1個糯稻品種(蘇御糯)，與第I類同處于1個主分支上，說明該類水稻品種的淀粉合成相關基因的序列更接近于粳稻;第III類包括4個秈稻品種(珍汕97B、龍特普B、桂朝2號和扎西瑪)，珍汕97B和龍特甫B的基因序列一致，與其余兩秈稻品種間均存在明顯差異。聚類圖可以反映出，淀粉合成相關基因在粳稻中具有較高的保守性，在秈稻中變異較大，秈稻品9311和明恢63具有更偏向于粳稻背景的基因型。

圖1 淀粉合成相關基因分子標記在17個水稻品種中的聚類分析Fig.1 Clustering analysis of 17 rice varieties

2.2 淀粉合成相關基因分子標記在粳稻品種間的多態性

粳稻品種間的淀粉合成基因相對保守，序列變異性較低，只能篩選到與武粳13有差異的2個基因型，因此，為了獲得更多有等位基因差異的粳稻品種，我們擴大了粳稻品種的數目，選擇了28個粳稻育種中廣泛使用的親本材料進行進一步篩選。利用48對在秈、粳、糯間具有多態性的分子標記進行多態性檢測，篩選到6個淀粉合成相關基因(SSIIa、SSIIIa、SSIIIb、SBE3、ISA、PUL)上的分子標記具有多態性，其中SSIIa和SSIIIb存在3種等位基因型，其余4個基因均存在2種等位基因型，圖2為6個基因上的分子標記檢測結果。

2.3 可溶性淀粉合成酶基因SSIIa、SSIIIa分子標記在粳稻育種品系中的檢測

在粳稻親本的篩選結果中，發現可溶性淀粉合酶基因SSIIa和SSIIIa的分子標記在關東194和武粳13間均表現出多態性。因此，利用SSIIa和SSIIIa的分子標記對關東194和武粳13雜交組合的88份后代衍生系進行了基因型檢測。在88份品系中分別檢測到SSIIa關194SSIIa關194和 SSIIa武13SSIIa武13基因型的品系分別為30個和58個，SSIIIa關194SSIIIa關194和SSIIIa武13SSIIIa武13基因型的品系分別為69和19個，檢測到2個基因的4種 基 因 型 SSIIa關194SSIIa關194/SSIIIa關194SSIIIa關194、SSIIa關194SSIIa關194/SSIIIa武13SSIIIa武13、SSIIa武13SSIIa武13/SSIIIa關194SSIIIa關194和SSIIa武13SSIIa武13/SSIIIa武13SSIIIa武13的品系分別為12個、18個、57個和1個(表1)。

圖2 淀粉合成相關基因分子標記在28個粳稻親本中的檢測結果Fig.2 The classification of 28 japonica rice based on the polymorphisms by the markers for six genes

表1 88份關東194/武粳13雜交育種品系的基因型檢測Table 1 Genotypic detection of 88 breeding lines derived from Guandong 194/Wujing 13

3 討論

近年來，隨著分子生物學的不斷發展，分子標記在水稻品種鑒定和遺傳育種中發揮著極其重要的作用。如利用SSR標記建立水稻品種的DNA指紋圖譜［18］，利用稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的基因內標記檢測抗病品種［19］，利用抗條紋葉枯病基因(Stv-bi)的SCAR標記定向改良水稻品種的條紋葉枯病抗性［20-21］。低直鏈淀粉含量基因(Wx-mq)的CAPs和四引物標記在優質育種中也有廣泛應用，利用分子標記已經培育出一系列含Wx-mq基因的優良食味粳稻品種如Milky Queen、關東194、南粳46、南粳9108等［22-25］。為了獲得更多具有利用價值的優良食味基因，本研究利用分子標記檢測的方法，對淀粉合成途徑中所有調控基因的基因型對17份秈、粳品種和28份粳稻親本進行了系統篩選。17份秈、粳品種的檢測結果表明，淀粉合成相關基因在秈粳亞種間表現出良好的多態性，在秈稻亞種內的變異較大，而在粳稻亞種內則相對保守，序列相似性較高。另外我們發現秈稻品種9311和明恢63中的淀粉合成相關基因的基因型更接近于粳稻，可能由于它們基因組上包含了粳稻背景如9311基因組被認為含30%的粳稻序列的緣故。該研究結果與前人利用SSR標記對不同水稻品種全基因組遺傳多樣性的鑒定結果［26-29］是相似的，從而說明了在水稻亞種間，淀粉合成相關基因的序列變異特征與其整個基因組序列的變異是一致的。

目前較多的研究結果表明，中國粳稻品種間特別是江蘇省育成的粳稻品種間遺傳多樣性單一，程寶山等［30］研究發現江蘇粳稻主栽品種遺傳相似系數為0.75～0.98，變異幅度很小。趙慶勇等［31］研究結果表明，江蘇省育成的水稻品種遺傳多樣性不夠豐富，多數品種間親緣關系較近。鑒于粳稻品種間遺傳背景單一的情況，我們在對28份粳稻親本的淀粉合成相關基因分子標記檢測結果中，仍特異性地篩選到6個基因的差異標記，找到了一些含差異等位基因的親本。如武粳13與關東194、寧0145等品種在可溶性淀粉合成酶基因SSIIa和SSIIIa上有等位基因差異，金粳18與關東194等品種在淀粉分支酶基因ISA和去分支酶基因PUL上有基因差異。我們對SSIIa和SSIIIa的分子標記在武粳13與關東194配置組合的后代品系中進行了驗證，獲得了一些含單基因和雙基因組合的材料，但是很遺憾我們只獲得1份含SSIIa武13SSIIIa武13雙基因型的材料，可能后續還需要增加檢測的樣本數量。另一方面，在后期研究中我們將測定這些品系的食味品質性狀，如直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度等淀粉相關理化參數，根據基因型與表型數據的差異顯著性分析，明確SSIIa和SSIIIa不同基因型間及雙基因組合間的遺傳效應大小，從而為粳稻品種食味品質的改良提供有用的基因型。

本研究通過對淀粉合成途徑上調控基因分子標記在不同品種間多態性的系統篩選，明確了含差異等位基因的水稻材料，證實了淀粉合成相關基因分子標記對育種材料進行基因型篩選的可行性，該研究結果為后續淀粉合成相關基因對食味品質的遺傳效應分析奠定了良好基礎，為水稻食味品質改良中的親本選擇、雜交后代的基因型篩選以及食味品質的定向改良提供了重要信息。

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