外源性S100a8和S100a9與結腸癌侵襲轉移的關系研究

摘要：目的 研究外源性S100a8和S100a9與結直腸癌侵襲轉移的關系。方法 Real-time PCR檢測巨噬細胞RAW264.7及結腸癌細胞CT26.WT中S100a8和S100a9的基因表達水平；ELISA檢測RAW264.7及CT26.WT細胞分泌至胞外的S100a8和S100a9的蛋白含量。劃痕實驗和Transwell實驗檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對結腸癌細胞侵襲轉移的影響。結果 S100a8和S100a9在巨噬細胞中的表達明顯高于結腸癌細胞（P=0.0126；P=0.03）；外源性S100a8和S100a9均能促進結腸癌細胞發生侵襲和轉移（P=0.0128；P=0.0011）。結論 結腸癌腫瘤微環境中S100a8和S100a9主要在巨噬細胞中高表達和分泌，并發揮促結腸癌侵襲轉移的作用，有可能成為治療結腸癌進展的新靶點。

關鍵詞：結直腸腫瘤；S100a8和S100a9；侵襲轉移

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其全球發病率呈逐年上升趨勢。我國結直腸癌發病率已躍居惡性腫瘤發病率的第3位，其病死率高達45.5%[1]，而腫瘤發生侵襲轉移被認為是腫瘤致死的重要因素。研究表明S100a8和S100a9在乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中高表達，且外源性的S100a8和S100a9與轉移前生態位的形成密切相關，促進腫瘤細胞的在轉移部位的定植[2-5]。本實驗著重闡述S100a8和S100a9在腫瘤微環境中的來源，并檢測外源性S100a8和S100a9對結直腸癌侵襲轉移的影響。

1 資料與方法

1.1主要細胞和試劑 小鼠結腸癌細胞CT26.WT和小鼠巨噬細胞RAW264.7均購自ATCC。主要試劑：引物和RNA抽提試劑盒Trizol（Invitrogen）；逆轉錄試劑盒（Fermentas）；熒光染料 SYBR Green Master Mix （Takara）；S100a8和S100a9 ELISA檢測試劑盒（USCNK Life Science）；小鼠S100a8和S100a9重組蛋白（Abnova）； Transwell 小室（Corning）；基質膠（BD Biosciences）；MTT（Sigma）。

1.2方法 Primer5軟件進行引物設計，小鼠S100a8上游引物5'-GACAATGCCGTCTGAACTGG；GCTACTCCTTGTGGCTGTCTT-3'；小鼠S100a9上游引物5'-ACCACCATCATCGACACCTTC；AAAGGTTGCCAACTGTGCTTC-3'；RNA抽提、逆轉錄、實時熒光定量PCR、Transwell實驗、劃痕實驗均嚴格按照說明書進行。以上實驗至少重復3次。

1.3統計學處理 應用GraphPad Prism 5 統計軟件進行統計學分析。計量資料分析采用t檢驗，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 S100a8和S100a9在巨噬細胞中的表達明顯高于結腸癌細胞 Real-time PCR結果顯示，巨噬細胞RAW264.7中S100a8和S100a9的基因表達水平明顯高于結腸癌細胞CT26.WT，P值分別為0.0126和0.03（圖1），差異具有統計學意義。ELISA方法同樣表明，巨噬細胞RAW264.7分泌至胞外的S100a8和S100a9蛋白含量明顯高于結腸癌細胞CT26.WT，P值分別為0.0128和0.0011（圖2），差異具有統計學意義。

圖1 Real-time PCR檢測巨噬細胞RAW264.7和小鼠結腸癌細胞CT26.WT中S100a8和S100a9的表達

圖2 ELISA檢測巨噬細胞RAW264.7和小鼠結腸癌細胞CT26.WT分泌的S100a8和S100a9

2.2外源性S100a8和S100a9促進結腸癌細胞侵襲和轉移 4ug/ml的S100a8和S100a9蛋白分別刺激小鼠結腸癌細胞CT26.WT，進行劃痕實驗觀測腫瘤細胞遷移能力。如圖3所示，外源性S100a8和S100a9蛋白均能促進結腸癌細胞的遷移，誘導傷口愈合。以同等濃度的S100a8和S100a9蛋白分別刺激CT26.WT，transwell實驗檢測腫瘤細胞的侵襲能力，如圖4所示，外源性S100a8和S100a9蛋白均能增強結腸癌細胞的侵襲能力。

圖3 劃痕實驗檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對CT26.WT遷移能力的影響

圖4 Transwell實驗檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對CT26.WT侵襲能力的影響

3 討論

結直腸癌是常見的惡性腫瘤，世界范圍內，每年約有120萬新發病例，約有60萬人死于結直腸癌[6]。我國結直腸癌年增加率為4.2%，高于全球平均遞增速度。結直腸癌的發生及發展是一個復雜的演變過程，其發生侵襲轉移是致死的重要原因。研究表明，腫瘤微環境中CXCL1、CCL2等多種細胞因子和趨化因子與腫瘤的侵襲轉移密切相關[7-8]。

S100a8和S100a9均屬于S100蛋白家族成員，為低分子量鈣結合蛋白，二者常以Ca2+ 依賴的方式形成S100a8/a9異源二聚體（又叫鈣衛蛋白）發揮生物學效應[9]。S100a8/a9主要在粒細胞、巨噬細胞和骨髓來源抑制細胞（MDSC）中表達，LPS、 TNF -a 、IL1β、 IL-10 、IL-22等炎癥因子刺激下S100a8和S100a9表達和分泌增強，且通常與TLR4和RAGE受體結合后激活多種信號通路發揮生物學效應[10-11]。本研究發現，S100a8和S100a9主要在巨噬細胞中表達和分泌，在結腸癌細胞中的表達和分泌相對較少。

研究表明，S100a8/9參與多種腫瘤的侵襲轉移，且內源性和外源性S100a8/a9對腫瘤的侵襲轉移扮演的角色各不相同，此特性可能依賴于胞外S100a8/a9濃度的變化。研究基本認為在20-250ug/ml濃度范圍內促進腫瘤細胞凋亡，小于20ug/ml的濃度促進腫瘤細胞增殖[12-14]。本研究證實，低濃度（4ug/ml）的S100a8和S100a9蛋白均能促進結腸癌細胞的侵襲和轉移。

總之，上述結果表明，結腸癌腫瘤微環境中巨噬細胞高表達和分泌S100a8和S100a9從而促進結直腸癌細胞發生侵襲和轉移，此研究結果為結直腸癌侵襲轉移機制的進一步研究提供了新思路，為結直腸癌侵襲轉移的診斷及靶向治療提供了重要的方向。

參考文獻：

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編輯/哈濤