大鼠結締組織生長因子siRNA熒光逆轉錄病毒表達載體的構建

摘要：目的 構建針對大鼠結締組織生長因子（connective tissue growth factor ，CTGF） 的小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）熒光逆轉錄病毒表達載體。方法 將體外合成的兩對各段含65堿基的寡核苷酸連接到pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體，構建重組質粒，同時設立非特異對照。結果 酶切、DNA 序列鑒定均證實插入片段的正確性。結論 成功地構建了鼠CTGF-siRNA熒光逆轉錄病毒表達載體。為進一步研究其對體內外抗纖維化作用打下基礎。

關鍵詞：CTGF； siRNA；熒光逆轉錄病毒表達載體

RNA干擾（RNA in terference， RNA i）是抑制目標基因的強有力的手段，人工合成的19-21核苷酸的干擾RNA在哺乳動物中能夠誘導序列專一性的RNA干擾作用，已經在哺乳動物RNA干擾的分子機制方面鋪平了道路[1]。大量研究證明， 結締組織生長因子（CTGF） 是組織器官纖維化的關鍵和共同因子，可介導血管內皮生長因子、轉化生長因子-β等多種信號刺激的纖維化效應，以CTGF為特異性靶標將給器官纖維化治療開創新紀元[2]。本研究通過設計針對大鼠CTGFmRNA的序列，構建能夠表達siRNA 的熒光逆轉錄病毒載體，旨在為進一步應用CTGF siRNAs抗纖維化研究創造條件。

1 資料與方法

1.1一般資料 pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體及JM109大腸桿菌菌種由中南大學湘雅醫學院醫學遺傳國家重點實驗室提供， siRNA序列及引物由大連寶生生物公司合成。

1.2方法

1.2.1 siRNA作用靶序列的選擇 按照siRNA作用靶序列的設計要求[3]，從大鼠CTGF基因最完整的編碼序列（序列號AF120275） 中設計4對序列分別為： T1序列為： 5′AgCTgACCTAgAggAAAAC，T2序列為： 5′AAgACACATTTggCCCTgA，T3序列為： 5′gTTCTAAgACCTgTgggAT，T4序列為： 5′CAggAAgATgTATggAgAC，陰性對照：CAgACAACTATgTACgTCg。經過BLAST[4]， 與同種屬的其它基因無同源性。

1.2.2.1退火 將正義和反義兩條鏈以100μM濃度1：1混合在PCR儀上95℃30s，72°C 2min，37°C for 2min，25°C for 2min。 行6%聚丙稀酰胺凝膠電泳，180V、30min，銀染后觀察退火是否成功。

1.2.2.2連接 pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體用EcorI、BamHI雙酶切完全后，跑膠，經過純化后退火，加入10ulT4連接酶體系，在16℃水浴中連接12～16h。

1.2.2轉化（按分子克隆實驗指南進行） 按常規操作方法連接并將重組載體轉化感受態細胞JM 109 后提取質粒。

1.2.3酶切、測序鑒定 由于插入片段設計使連接后載體上形成新的酶切位點（MluI），選擇能被MluI單酶切的克隆，擴大培養后抽提質粒送測序。測序引物序列為Forward Sequencing Primer： 5'-ATGATCATACTTACCGTAACGTTG-3'。測序由上海英駿生物技術有限公司完成。

2 結果

2.1酶切鑒定 連接后載體用MluI單酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示T1、 T2、T3、T4、T5組克隆出現大小約6.5kb的線形化條帶， 而陰性對照組為空質粒pRZ。陽性質粒分別命名為： pRZT1、 pRZT2、pRZT3、 pRZT4 、 pRZT5 ，見圖1（Fig 1）。

1： pRZT1； 2： pRZT2； 3： pRZT3； 4： pRZT4 ； 5： pRZT5 6： pRZ M： DNA/ Hind Ⅲ Marker

Fig1 Enzyme digestion analysis of pRZ-siRNA expression vectors

圖1 pRZ-siRNA重組質粒酶切鑒定

2.2測序結果 CTGF-siRNA逆轉錄病毒熒光載體測序結果經DNAstar軟件與標準序列進行拼接后顯示，連入序列正確，無突變。見圖2。

圖2 pRZ-siRNA重組質粒測序拼接圖

3 討論

隨著人類基因治療技術的迅速發展，越來越多基因治療方案進入臨床試驗，以逆轉錄病毒作為介導載體也是目前基礎和臨床研究中最常用的基因轉染方法。能在哺乳類細胞中直接表達siRNA 的質粒載體系統的發明和改進[5]，使基于載體表達的方法制備siRNA最為優越。質粒、病毒類載體介導的siRNA表達方法的出現，克服了化學合成與體外轉錄方法時siRNA進入細胞后容易被降解，進入細胞siRNA在細胞內的RNAi效應持續時間短等缺點。由于質粒可以復制擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本[6]。

我們選擇帶有ZsGreen熒光標記的缺陷型逆轉錄病毒載體pSIREN- RetroQ-ZsGreen，將大鼠CTGF-siRNA克隆至該載體，進行病毒包裝并篩選具有高滴度感染性重組病毒產生細胞系的研究。我們所采用的逆轉錄病毒表達系統整合，大大提高siRNA表達載體對宿主細胞的侵染性，徹底克服某些細胞轉染效率低的障礙。我們通過熒光標記很容易觀察到載體的轉染效率及目的基因的沉默效率。本研究針對大鼠CTGF基因構建siRNA 的熒光逆轉錄病毒載體，以期持續穩定地抑制該基因的表達，為延緩器官纖維化的基因治療提供一種可能途徑。

參考文獻：

[1]Elbashir SM， Harborth J， Lendeckel W， et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature，2001，411：494-498.

[2]Rachfal， A.W.， and Brigstock， D.R. Connective tissue growthfactor （CTGF/CCN2） in hepatic fibrosis[J]. Hepatol Res，2003 26： 1-9.

[3]http：//bioinfo2.clontech.com/rnaidesigner/

[4]http： //www. ncbi.nlm.nih.gov/Blast/

[5]Tripathi AK， UV Ramani， AK Patel，et al. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro[J]. Appl Biochem Biotechnol，2013，169（2）：688-694. [6]Tripathi AK， UV Ramani， AK Patel，et al. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro[J]. Appl Biochem Biotechnol，2013，169（2）：688-694. 編輯/哈濤