大鼠結(jié)締組織生長因子siRNA熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建

摘要：目的 構(gòu)建針對大鼠結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor ，CTGF） 的小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體。方法 將體外合成的兩對各段含65堿基的寡核苷酸連接到pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，同時設立非特異對照。結(jié)果 酶切、DNA 序列鑒定均證實插入片段的正確性。結(jié)論 成功地構(gòu)建了鼠CTGF-siRNA熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體。為進一步研究其對體內(nèi)外抗纖維化作用打下基礎。

關(guān)鍵詞：CTGF； siRNA；熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體

RNA干擾（RNA in terference， RNA i）是抑制目標基因的強有力的手段，人工合成的19-21核苷酸的干擾RNA在哺乳動物中能夠誘導序列專一性的RNA干擾作用，已經(jīng)在哺乳動物RNA干擾的分子機制方面鋪平了道路[1]。大量研究證明， 結(jié)締組織生長因子（CTGF） 是組織器官纖維化的關(guān)鍵和共同因子，可介導血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等多種信號刺激的纖維化效應，以CTGF為特異性靶標將給器官纖維化治療開創(chuàng)新紀元[2]。本研究通過設計針對大鼠CTGFmRNA的序列，構(gòu)建能夠表達siRNA 的熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，旨在為進一步應用CTGF siRNAs抗纖維化研究創(chuàng)造條件。

1 資料與方法

1.1一般資料 pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體及JM109大腸桿菌菌種由中南大學湘雅醫(yī)學院醫(yī)學遺傳國家重點實驗室提供， siRNA序列及引物由大連寶生生物公司合成。

1.2方法

1.2.1 siRNA作用靶序列的選擇 按照siRNA作用靶序列的設計要求[3]，從大鼠CTGF基因最完整的編碼序列（序列號AF120275） 中設計4對序列分別為： T1序列為： 5′AgCTgACCTAgAggAAAAC，T2序列為： 5′AAgACACATTTggCCCTgA，T3序列為： 5′gTTCTAAgACCTgTgggAT，T4序列為： 5′CAggAAgATgTATggAgAC，陰性對照：CAgACAACTATgTACgTCg。經(jīng)過BLAST[4]， 與同種屬的其它基因無同源性。

1.2.2.1退火 將正義和反義兩條鏈以100μM濃度1：1混合在PCR儀上95℃30s，72°C 2min，37°C for 2min，25°C for 2min。 行6%聚丙稀酰胺凝膠電泳，180V、30min，銀染后觀察退火是否成功。

1.2.2.2連接 pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體用EcorI、BamHI雙酶切完全后，跑膠，經(jīng)過純化后退火，加入10ulT4連接酶體系，在16℃水浴中連接12～16h。

1.2.2轉(zhuǎn)化（按分子克隆實驗指南進行） 按常規(guī)操作方法連接并將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM 109 后提取質(zhì)粒。

1.2.3酶切、測序鑒定 由于插入片段設計使連接后載體上形成新的酶切位點（MluI），選擇能被MluI單酶切的克隆，擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒送測序。測序引物序列為Forward Sequencing Primer： 5'-ATGATCATACTTACCGTAACGTTG-3'。測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1酶切鑒定 連接后載體用MluI單酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示T1、 T2、T3、T4、T5組克隆出現(xiàn)大小約6.5kb的線形化條帶， 而陰性對照組為空質(zhì)粒pRZ。陽性質(zhì)粒分別命名為： pRZT1、 pRZT2、pRZT3、 pRZT4 、 pRZT5 ，見圖1（Fig 1）。

1： pRZT1； 2： pRZT2； 3： pRZT3； 4： pRZT4 ； 5： pRZT5 6： pRZ M： DNA/ Hind Ⅲ Marker

Fig1 Enzyme digestion analysis of pRZ-siRNA expression vectors

圖1 pRZ-siRNA重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2測序結(jié)果 CTGF-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒熒光載體測序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件與標準序列進行拼接后顯示，連入序列正確，無突變。見圖2。

圖2 pRZ-siRNA重組質(zhì)粒測序拼接圖

3 討論

隨著人類基因治療技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多基因治療方案進入臨床試驗，以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為介導載體也是目前基礎和臨床研究中最常用的基因轉(zhuǎn)染方法。能在哺乳類細胞中直接表達siRNA 的質(zhì)粒載體系統(tǒng)的發(fā)明和改進[5]，使基于載體表達的方法制備siRNA最為優(yōu)越。質(zhì)粒、病毒類載體介導的siRNA表達方法的出現(xiàn)，克服了化學合成與體外轉(zhuǎn)錄方法時siRNA進入細胞后容易被降解，進入細胞siRNA在細胞內(nèi)的RNAi效應持續(xù)時間短等缺點。由于質(zhì)粒可以復制擴增，相比起其它合成方法來說，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本[6]。

我們選擇帶有ZsGreen熒光標記的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIREN- RetroQ-ZsGreen，將大鼠CTGF-siRNA克隆至該載體，進行病毒包裝并篩選具有高滴度感染性重組病毒產(chǎn)生細胞系的研究。我們所采用的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)整合，大大提高siRNA表達載體對宿主細胞的侵染性，徹底克服某些細胞轉(zhuǎn)染效率低的障礙。我們通過熒光標記很容易觀察到載體的轉(zhuǎn)染效率及目的基因的沉默效率。本研究針對大鼠CTGF基因構(gòu)建siRNA 的熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以期持續(xù)穩(wěn)定地抑制該基因的表達，為延緩器官纖維化的基因治療提供一種可能途徑。

參考文獻：

[1]Elbashir SM， Harborth J， Lendeckel W， et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature，2001，411：494-498.

[2]Rachfal， A.W.， and Brigstock， D.R. Connective tissue growthfactor （CTGF/CCN2） in hepatic fibrosis[J]. Hepatol Res，2003 26： 1-9.

[3]http：//bioinfo2.clontech.com/rnaidesigner/

[4]http： //www. ncbi.nlm.nih.gov/Blast/

[5]Tripathi AK， UV Ramani， AK Patel，et al. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro[J]. Appl Biochem Biotechnol，2013，169（2）：688-694. [6]Tripathi AK， UV Ramani， AK Patel，et al. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro[J]. Appl Biochem Biotechnol，2013，169（2）：688-694. 編輯/哈濤