2011～2013年某市手足口病標(biāo)本病毒檢測(cè)結(jié)果分析

摘要：目的 對(duì)2011～2013年某市手足口病病例的不同標(biāo)本進(jìn)行病原體檢測(cè)和分析，了解到本市的手足口病感染狀況。方法 對(duì)臨床診斷為手足口病的患者的糞便標(biāo)本460份，咽拭子標(biāo)本549份（EV陽(yáng)性345份，EV71陽(yáng)性23份，CA16陽(yáng)性13份），用RT-PCR是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸道通用病毒、CVA16和EV71，華山的急性期血清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)EV71和CAV16的IgM抗體。結(jié)果 患者的糞便標(biāo)本腸道病毒總陽(yáng)性率為82.26%（378/460），CVA16的陽(yáng)性率為37.40%（172/460），EV71的陽(yáng)性率為25.41%（116/460），其他腸道病毒為19.66%（90/460），CVA16行陽(yáng)性率高于EV71。糞便標(biāo)本的腸道病毒陽(yáng)性率高于咽拭子的38.75%（345/549）（χ2=27.01，P<0.01）。發(fā)病年齡多為1～5歲，主要集中在3歲左右，男性患者多余女性患者。對(duì)手足口病病例的急性期血清進(jìn)行酶免疫檢測(cè)，EV71和CVA16的陽(yáng)性率分別為28.70%（31/108）和33.33%（36/108） ，和糞便標(biāo)本的陽(yáng)性率的核酸檢測(cè)比較，有較高的相關(guān)性。結(jié)論 2011～2013年度本市的手足口病疫情以腸道病毒通用型為主，糞便標(biāo)本的陽(yáng)性率較高，急性期血清的免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分子生物系相符，采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)手足口病的病原體，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體，對(duì)手足口病的診斷有重要作用。

關(guān)鍵詞：手足口病；腸道病毒；EV71；CA16

手足口病（ Hand-foot-and-mouth disease，HFMD） 是由多種腸道病毒（EV） 引起的常見(jiàn)傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童，大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，個(gè)別重癥患兒如果病情發(fā)展快，可導(dǎo)致死亡[1]，引起手足口病最常見(jiàn)病原為柯薩奇病毒A組16型（CVA16）和腸道病毒71型（ EV71），2007年北京市將手足口病納入全市傳染病常規(guī)報(bào)告系統(tǒng)，2008年5月2日起，手足口病納入我國(guó)丙類傳染病管理，北京市順義區(qū)自2006年初開(kāi)始有手足口病例報(bào)告，近年來(lái)，HFMD發(fā)病率顯著升高，并呈現(xiàn)季節(jié)性流行和全年散發(fā)趨勢(shì)，現(xiàn)對(duì)2011～2013年北京市順義區(qū)手足口病病原學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探索手足口病病原學(xué)特征，為手足口病防控工作提供科學(xué)依據(jù)[2]。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集對(duì)象的選擇和數(shù)量 標(biāo)本采集對(duì)象為疫情出現(xiàn)時(shí)手足口病的臨床診斷病例。用于進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)本有糞便、咽拭子和血清。臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過(guò)程中避免反復(fù)凍融，如果不能確保-20℃的條件，應(yīng)該在 0～8℃運(yùn)輸和保存。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，不能立即進(jìn)行檢測(cè)的放置于-80℃冰柜中低溫保存，其中包括本地醫(yī)院臨床診斷為手足口病的患者糞便標(biāo)本460份，咽拭子549份，血清108份。

1.2標(biāo)本的種類及采集于運(yùn)輸 糞便標(biāo)本：采集患者發(fā)病7d內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量為5～8g/份，采集后的糞便立即放入無(wú)菌采便管內(nèi)，4℃暫時(shí)保存或者于12h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，-0℃以下低溫冷凍保存，若需要長(zhǎng)期保存則將標(biāo)本置于-80℃冰箱內(nèi)。

咽拭子標(biāo)本：采集患者發(fā)病3d內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用的棉簽采集，適度用力擦拭涂抹于咽后壁和兩側(cè)的扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；然后迅速將棉簽放入裝有3mlHank’s保存液的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊封蓋并密封，以防止干燥。4℃暫存或12h內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室，-20℃以下低溫冷凍包藏，若需要長(zhǎng)期保存則將標(biāo)本置于-80℃冰箱。

血清標(biāo)本：采集發(fā)病0～3d的急性期病例血清用于抗體檢測(cè)。靜脈采集3～5ml全血，置于真空無(wú)菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于-20℃以下的冰箱中冷凍保存。

1.3主要試劑和儀器 檢測(cè)試劑采用中山大學(xué)達(dá)安基因公司制備的熒光法專用核酸檢測(cè)試劑盒。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行病毒RNA抽提，設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用abi7500熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.4標(biāo)本處理 在生物安全柜內(nèi)，取5g左右的手足口病病例的糞便標(biāo)本，放入50ml離心管，標(biāo)記標(biāo)本號(hào)，每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠和1ml氯仿；用振蕩器劇烈振蕩40min；用冷凍離心機(jī)1500g離心20min；在生物安全柜中將每一份標(biāo)本的上清液分別吸入2個(gè)帶螺旋蓋的凍存管中；一管糞便懸液凍存于-70℃作為備份，另一管用于病毒檢測(cè)和病毒培養(yǎng)。

咽拭子要在標(biāo)本保存液中充分?jǐn)噭?dòng)或振蕩（至少40下） ，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，用于病毒分離時(shí)，需要凍融一次（防止多次凍融），使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒！然后在4℃條件下，10000r/min離心20min，用上清接種到細(xì)胞上或直接提取RNA。

1.5 Real time-PCR擴(kuò)增 熒光定量PCR法的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析多個(gè)總體率或構(gòu)成比之間差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同標(biāo)本之間的檢測(cè)結(jié)果 2011～2013這3個(gè)年度的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)手足口患者所采集的標(biāo)本有糞便標(biāo)本、咽拭子標(biāo)本、血清標(biāo)本三類。在糞便標(biāo)本中，選擇合適的標(biāo)本460份。其中，糞便和咽拭子兩類標(biāo)本核酸檢測(cè)的腸道病毒陽(yáng)性率分別為82.26%和37.40%，糞便標(biāo)本的腸道病毒陽(yáng)性率高于咽拭子的38.75%（345/549）（χ2=27.01，P<0.01），兩類標(biāo)本的陽(yáng)性率之間具有顯著性差異。急性期的血清標(biāo)本采用ELISA檢測(cè)，雖然只能檢測(cè)EV71和CVA16，但陽(yáng)性率較高（見(jiàn)表1）。

2.2 RT-PCR和Real time檢測(cè)結(jié)果

2.2.1手足口病的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果10份標(biāo)本的手足口病腸道病毒通用引物RT-PCR結(jié)果顯示，10份標(biāo)本俊文陽(yáng)性，基因擴(kuò)增片段為116bp（圖1）。16份標(biāo)本的手足口病腸道病毒EV71特異性引物的RT-PCR結(jié)果顯示，2、3、4、6、9、10、16號(hào)標(biāo)本為陽(yáng)性，基因擴(kuò)增片段為226bp（如圖2）。在手足口病腸道病毒CVA16特異性引物的RT-PCR結(jié)果中顯示，除了8、9均為陽(yáng)性，基因擴(kuò)增片段為208bp（如圖3）。

圖1 手足口病腸道病毒通用引物RT-PCR結(jié)果

M：Marker，1～10：通用引物

圖2 手足口腸道病毒EV71特異性引物PT-PCR結(jié)果

M：marker，1～16：EV71：71：陰性對(duì)照，18：陽(yáng)性

圖3 手足口病腸道病毒CVA16特異性引物RT-PCR結(jié)果

M：Maeker，1～10：CVA16，11：陽(yáng)性對(duì)照

2.2.2手足口病的Real time-PCR檢測(cè)結(jié)果（如圖4）

3 討論

手足口病屬于全球傳染病，世界大部分地區(qū)均有手足口流行病的報(bào)道。我國(guó)于1981年開(kāi)始在上海，以后北京、河北、福建等10多個(gè)省市先后都有報(bào)道。1999年夏季在廈門(mén)市流行的手足口病證實(shí)為EV71型引起。1985年香港出現(xiàn)EV71流行病，1987年湖北省也出現(xiàn) EV71流行病。1998年中國(guó)臺(tái)灣出現(xiàn)了歷史規(guī)模最大的手足口病大流行，診斷129106例，其中405個(gè)兒童為重癥病例，死亡78例[3]，2008年3月在安微，手足口病爆發(fā)是由EV71引起，同樣出現(xiàn)多例死亡病例[4]，EV71引起重癥感染的比例較大[5]，引起全社會(huì)的高度關(guān)注。2006、2007年，龍巖市均有手足口病散發(fā)的病例，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)證實(shí)由 COXA16感染引起，患者病情較輕。2008年9月下旬，龍巖市手足口病爆發(fā)、流行，疫情波及全市各個(gè)縣（市、區(qū)），出現(xiàn)多例重癥病例，其中1例死亡。

手足口病的發(fā)病年齡多為1～5歲，主要集中在3歲左右，男性患者多余女性患者。對(duì)手足口病病例的急性期血清進(jìn)行酶免疫檢測(cè)，EV71和CVA16的陽(yáng)性率分別為28.70%（31/108）和33.33%（36/108），和糞便標(biāo)本的陽(yáng)性率的核酸檢測(cè)比較，有較高的相關(guān)性。2011～2013年度本市的手足口病疫情以CVA16為主，糞便標(biāo)本的陽(yáng)性率較高，急性期血清的免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分子生物系相符，采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)手足口病的病原體，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體，對(duì)手足口病的診斷有著重要作用，但是通常情況下，Cox A16引起的疾病預(yù)后相對(duì)較好，多為散發(fā)，極少導(dǎo)致手足口病的大規(guī)模暴發(fā)；而EV71型腸病毒則較兇險(xiǎn)，除了引起手足口病以外，EV71較 Cox A16所致手足口病有更多機(jī)會(huì)可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。因此，在今后臨床中應(yīng)注重埃可病毒感染手足口病患者的防治工作，尤其是EV71型患者，收治重點(diǎn)為早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免危重癥的發(fā)生。

在本研究結(jié)果中顯示的數(shù)據(jù)中可以看出，手足口病患者中多以EV、EV71型為主，說(shuō)明在患者當(dāng)中多以埃可病毒屬感染為主要病源，可能存在EV型和非EV71亞型協(xié)同感染；CoxA16僅僅占了很少數(shù)的比例。通過(guò)研究，我們可以為手足口病預(yù)防和控制提供更好的依據(jù)，更好的分析病因，掌握病毒病原體的流行特征，找出解決手足口病的辦法，更快的治療手足口病患者，使患者更早的脫離痛苦。以此，以減少手足口病的流行爆發(fā)、傳染，以及死亡病例的發(fā)生。

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編輯/王敏