大孔吸附樹脂純化甘草提取物中甘草酸的研究

摘要：目的 研究光果甘草中甘草酸的最佳大孔樹脂純化工藝。方法 以大孔吸附樹脂純化物中甘草酸的含量為考察指標，從24種大孔吸附樹脂中篩選出純化甘草粗提物中甘草酸的最佳大孔吸附樹脂，并確定純化甘草酸的最佳工藝條件。結果 AB-8大孔吸附樹脂純化甘草酸效果最佳，最佳工藝條件：上柱液濃度為0.11mg/mL，徑高比為1：8，上樣體積為所用樹脂2BV，上樣速度與洗脫速度均為2BV/h，用30%、50%的乙醇除雜，用80%乙醇富集甘草酸。純化后產品純度為60.74%，收率為3.29%，轉移率為76.33%。結論 采用AB-8大孔吸附樹脂可較好地純化甘草酸。

關鍵詞：甘草；甘草酸；AB-8大孔吸附樹脂

藥用甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fish.）， 脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Batalin）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根莖[1]。甘草為藥食兩用植物，甘草酸又稱甘草皂苷，是甘草的主要活性成分之一，具有促腎上腺皮質激素作用，能減少尿量及鈉排出，增加鉀排出，血鈉上升，血鈣降低。可用于解毒，抗炎[2]，鎮咳，抗腫瘤，抗潰瘍，抗菌等[3]。近年來的藥理研究發現，甘草酸類藥物對防治病毒性肝炎、高血脂癥和癌癥等疾病有一定的療效[3-4]，對艾滋病毒也有一定的抑制增殖作用[5]。

長期以來，我國是甘草主要出口國，但產品多為原草或浸膏等初加工產品，缺乏深加工。研究有工業應用價值的甘草酸分離與精制技術具有重要意義。本實驗將考察24種大孔樹脂，選擇出最優樹脂進行甘草酸的純化實驗，并確定純化的最佳條件。制定出穩定可靠，成本低廉的純化工藝，以期對工業化生產有所幫助。

1 材料

LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津公司），FA10004N型萬分之一分析天平（上海精密科學儀器有限公司），樹脂（河北滄州寶恩吸附材料有限公司），甲醇色譜純（天津市康科德科技有限公司），冰醋酸分析純（天津市康科德科技有限公司），醋酸銨分析純（天津市北方天醫化學試劑場），光果甘草（購于河北安國藥市長安中藥材有限公司，經李天翔教授（天津中醫藥大學）鑒定），剪段約為3cm，砸至酥松，50℃干燥備用。甘草酸單銨鹽對照品（批號為110731-201115，購于天津市藥品檢驗所，純度>98%）。

2 方法與結果

2.1甘草酸含量測定

2.1.1色譜條件 色譜柱為MERITECH-C18柱（4.6mm×200mm，5μm），流動相： 甲醇-0.2mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸（67：32：1），柱溫：30℃，流速：1ml/min，檢測波長：254nm，進樣體積10μl[6]。

2.1.2對照品溶液制備 精密稱取甘草酸單銨鹽對照品，置于5ml容量瓶，加流動相至刻度，搖勻，制成0.2165mg/ml的標準溶液，冷藏備用。

2.1.3供試品溶液制備 0.3%的氨水按液料比12：1與甘草飲片回流提取1.5h，提取2次，合并提取液，濃縮后干燥得粗提物樣品。精密稱取甘草粗提取物樣品0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相25ml，稱定重量，超聲處理20min，取出，放冷，再稱定重量，用流動相補足減失重量，搖勻，濾過，即得。

2.1.4標準曲線的制備[6] 精密吸取甘草酸單銨鹽對照品液2、6、10、14、18、20μl 分別注入液相色譜儀，以峰面積（A）對質量數（M）進行線性回歸計算。以對照品質量數為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，得回歸方程為Y=9.6E+5x -10356，r2=0.9999。結果表明，甘草酸在0.4330～3.8970μg呈良好的線性關系（見圖1）。

2.1.5精密度試驗 分別精密吸取供試品溶液10μl， 重復進樣5次，按\"2.1\"中的色譜條件測定，記錄色譜，測得甘草酸峰面積，得RSD=1.41%。表明甘草酸精密度良好。

2.1.6重復性試驗 取樣品按供試品溶液制備方法制備5份供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液10μl進樣，記錄色譜，測得甘草酸面積，得RSD=2.12%。表明甘草酸重復性良好。

2.1.7穩定性試驗 取供試品溶液分別在0、2、4、6、8、10、24h進樣，測定峰面積積分值，得RSD=1.12%。結果表明甘草酸在24h內穩定性良好。

2.1.8加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的甘草粗提物粉末約0.05 g，加入甘草酸對照品適量，按供試品溶液制備方法制備，測定其含量，并計算回收率，結果見表1。RSD=0.94%，表明此法加樣回收率良好。

2.2 大孔吸附樹脂純化甘草酸工藝參數

2.2.1 大孔樹脂的活化 精密稱取1g大孔樹脂封于熱封型茶袋中，放入足量無水乙醇中浸泡3h，蒸餾水洗至無醇味，置5%鹽酸中浸泡2～3h后，蒸餾水洗至中性[7]，待用。

2.2.2大孔樹脂的篩選 精密稱取1g經處理后的不同型號大孔樹脂封于熱風型茶袋中，置于15ml離心管中，加10mL甘草供試品溶液于離心管，振搖5h，取樣，測定其中甘草酸濃度計算吸附率。大孔樹脂繼續飽和至24h后棄去藥液，加入10ml60%乙醇，振搖5h后，取樣，測定其中甘草酸濃度，計算解析率。

綜合吸附與解吸附情況，結果表明AB-8型大孔吸附樹脂純化甘草酸效果最佳。吸附量為9.8900mg/g，吸附率為96.53%，解析率為62.92%（見表2）。

2.2.3最佳大孔樹脂的吸附和解吸附情況考察 精密稱取5份1g經過處理的AB-8大孔樹脂封于熱風型茶袋中，置于15ml離心管中，加10ml甘草供試品溶液于離心管，振搖5h。取樣，測定其中甘草酸濃度，計算吸附率。大孔樹脂繼續飽和至24h后棄去藥液，加入10mL60%乙醇，振搖2h后，取樣，測定其中甘草酸濃度，計算解析率。

最佳大孔樹脂AB-8的平均吸附量為5.8233mg/g，平均吸附率為96.42%，平均解析率為61.96%（見表3）。

2.2.4 洗脫濃度的選擇 按\"2.2.2\"制備飽和吸附的AB-8大孔樹脂，在盛有飽和吸附的大孔樹脂的離心管中分別加入10mL30%，50%，60%，70%，80%，90%，95%乙醇，振搖5h后取樣，測定其中甘草酸濃度[7]。并制作洗脫濃度選擇曲線，優選出最佳洗脫濃度。最終得出選用80%的乙醇作為洗脫劑最佳，結果見圖2。

2.2.5 上樣速度的確定 取5份8mL預處理好的AB-8大孔樹脂裝柱，50%乙醇洗至流出液無色，再用蒸餾水洗至無醇味。取5mL甘草供試品溶液分別以1BV/h，2BV/h，3BV/h，4BV/h，5BV/h的速度進行上樣，用15mL蒸餾水除雜后，80%乙醇以2BV/h速度進行洗脫，收集餾分，測定其中甘草酸濃度，選出最佳上樣速度。實驗結果表明最佳上樣速度為2BV/h（見圖3）。

2.2.6上樣量的確定 取8ml預處理后的AB-8大孔樹脂裝柱，50%乙醇洗至流出液無色，再用蒸餾水洗至無醇味。取濃度為5.7029mg/ml甘草酸粗提液，不斷上樣，以1ml為一份餾分，取樣，測定其中甘草酸濃度，所測物質含量達到基本穩定，制作動態泄漏曲線。可知最佳上樣量為16ml，即2BV（見圖4）。

2.2.7洗脫速度的確定 取3份8ml預處理后的AB-8大孔樹脂裝柱，50%乙醇洗至流出液無色， 再用蒸餾水洗至無醇味。取5ml甘草供試品溶液以2BV/h上樣，用15ml蒸餾水除雜后，用20ml80%乙醇分別以1、2、3BV/h的速度洗脫，以1ml為一餾分，取樣，測定其中甘草酸濃度，制作洗脫速度選擇曲線。制作洗脫速度選擇曲線，結果表明最佳洗脫速度為2BV/h（見圖5）。

圖1 甘草酸標準曲線

圖2 洗脫劑濃度選擇

圖3 上樣速度選擇

圖4 上樣量的選擇

圖5 洗脫速度的確選擇

2.2.8洗脫劑量的確定 取8ml預處理后的AB-8大孔樹脂裝柱，50%乙醇洗至流出液無色，再用蒸餾水洗至無醇味。取5mL甘草供試品溶液以2BV/h上樣，用15ml蒸餾水除雜后，用20ml80%乙醇以2BV/h洗脫，以1ml為一餾分，取樣，測定其中甘草酸濃度。制作洗脫劑量曲線，制作洗脫劑量曲線，選出最適洗脫劑量為16ml，即2BV（見圖6）。

圖6 洗脫劑量的選擇

2.2.9除雜、純化后含量測定 取8ml預處理后的AB-8大孔樹脂裝柱，50%乙醇洗至流出液無色，再用蒸餾水洗至無醇味。取5mL甘草供試品溶液以2BV/h上樣，用15ml蒸餾水除雜后，用20ml80%乙醇以2BV/h洗脫，收集餾分，將所收集餾分揮干，放置于烘箱中干至恒重，計算出膏率，用流動相定容至容量瓶中，取樣，測定其中甘草酸濃度，計算純度。標準品、純化前后的樣品色譜圖如圖7～9。

圖7 甘草酸標準品色譜圖

圖8 甘草酸樣品純化前色譜圖

圖9 甘草酸樣品純化后色譜圖

2.2.10 驗證試驗 按照以上最佳條件進行驗證試驗，得出結果，對整個實驗進行評價。結果表明收率為3.29%，轉移率為76.72%，純度為60.7%（見表4）。

3 討論

甘草酸提取液的制備一般有煎煮法、水提醇沉法、超聲波法、氨水提取法等。經實驗比較超聲提取的出膏率只有20%左右，而用氨水提取可達到30%左右[8]，而且甘草酸易溶于氨水，形成更加穩定的甘草酸單銨鹽，有利于后續提取純化。在純化上，大孔吸附樹脂作為一種有效的分離手段，大部分文獻中均選擇使用大孔吸附樹脂對甘草酸進行純化。

本實驗中對24種大孔吸附樹脂進行篩選，從實驗數據上分析，其中AB-8型大孔樹脂靜態飽和吸附量為9.80mg/g，僅次于S-8型樹脂的10.0957mg/g；靜態吸附率為96.53%，也僅次于S-8型樹脂的98.54%； 靜態洗脫率為62.92%，但S-8型樹脂的洗脫率為0%，可以直接排除了選用S-8型樹脂的可行性。從性質上分析，AB-8型樹脂是一個交聯聚合物，在其骨架結構中附加了親水基團，在其結構中僅有非離子化功能基，其具有相當大的比表面和適宜的孔徑，其適于從水溶液中提取分離甘草酸，且AB-8型是弱極性大孔樹脂，其與甘草酸的極性相近，對甘草酸的吸附率較高。最終可得到AB-8型大孔樹脂為甘草酸純化最佳樹脂。

測定AB-8型大孔樹脂動態數據：動態吸附量為13.7 mg/8 mL ，吸附率為96%，解析率可達61%。基于以上數據，建立了利用 AB-8大孔樹脂純化甘草酸的各項工藝參數：上柱液濃度為0.11mg/mL，徑高比為1：8，上樣體積為所用樹脂2BV，上樣速度與洗脫速度均為2BV/h，用30%、50%的乙醇除雜，用80%乙醇富集甘草酸。本實驗顯示，經一次純化后，甘草酸的含量就可達60%左右，在生產上，如需更高含量可進行二次純化。

參考文獻：

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[7]高宏，兀江波，曹霞萍. AB-8大孔樹脂對甘草粗提取液的最佳動態純化條件[J]. 中國現在藥物應用，2011，5（23）：71-72.

[8]黃慧蓮，周燕雙，宋麗莉.不同提取工藝下甘草提取物種甘草酸銨含量測定研究[J]. 中國當代醫藥，2011，18（33）：47-50.編輯/王敏