產高光學純度D—乳酸野生菌株的分離篩選

摘要：目的 從某發酵食品中分離篩選出產高光學純度D-乳酸的野生菌株。方法 用平板劃線法對某發酵食品中的野生菌株進行分離純化，用高壓液相色譜法測定所分離野生菌株發酵液中D-乳酸的光學純度，篩選出產高光學純度D-乳酸的菌株。結果 從某發酵食品中共分離篩選出9株野生菌株，產D-乳酸的光學純度達100%，將其命名為SZD菌株。結論 某發酵食品中存在產光學純度為100%D-乳酸的野生菌株。

關鍵詞：D-乳酸；棒狀乳桿菌；分離

右旋乳酸（D-乳酸）是一種重要的可降解的化工原料，由其單體聚合而成的聚乳酸可應用于手術縫合線、冠脈覆膜支架和骨折內固定材料等[1]。生產乳酸大多采用發酵法，發酵法制備D-乳酸的主要技術瓶頸是缺乏產高光學純度（光學純度>97%）D-乳酸的菌株[2]。筆者在觀察某發酵食品原液抑菌活性的過程中意外發現此發酵食品原液中含有較高光學純度的D-乳酸。本研究擬從該發酵食品原液中分離篩選出產高光學純度D-乳酸的野生菌株。

1 資料與方法

1.1試劑 發酵食品原液采自陜西的一種發酵食品，該食品的細節因專利保護的需要目前不便公開。MRS肉湯培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司）。L-乳酸（色譜純，純度98%）及D-乳酸（色譜純，純度93%）均由美國西格瑪-奧德里奇公司出品。

1.2實驗儀器 Waters高效液相色譜儀2695（美國沃特世公司），waters紫外檢測器2489（美國沃特世公司）；色譜柱：型號為Chirex 3126（D）-penicillami的手性柱（美國菲羅門公司）。

1.3方法

1.3.1菌株的分離、純化 用滅菌接種環取發酵食品原液在MRS平板上三區劃線接種，35℃燭缸法培養48h后觀察菌落生長情況。用滅菌接種環從平板上選取菌落形態不同的菌落，分別采用三區劃線法接種于不同的MRS平板，35℃燭缸法培養48h，觀察每個平板菌落形態是否一致，重復以上操作直至每個平板上菌落形態一致。

1.3.2產高光學純度D-乳酸菌株的篩選 色譜條件：流動相：2mmol/L CuSO4溶液（溶劑為5%的異丙醇溶液），使用前經0.45μm濾膜過濾；流動相流速為0.7mL/min；柱溫30℃；紫外檢測器，檢測波長為254 nm。

從分離純化后的菌株中選取G+桿菌，將其新鮮培養物接種于MRS液體培養基，35℃靜置培養48h。將發酵液12880×g離心15min，上清液用0.45μm濾膜過濾，取1mL濾液適當稀釋后超聲脫氣，即為待測液；將未接種細菌的MRS液體培養基經同樣處理作為陰性對照。按上述色譜條件準備好色譜儀和流動相。將待測液樣品加入樣品瓶中，進樣量20μL，進樣時間30min。使用標準曲線法，根據已建立的標準曲線積分計算出待測液樣品中D-乳酸及L-乳酸的含量。從上述野生菌株中篩選出產高光學純度D-乳酸的菌株。

2 結果

共分離純化出26株產乳酸的G+桿菌，產D-乳酸的光學純度為58.19%～100%。其中有9株產D-乳酸的光學純度為100%，命名為SZD菌株，分別編號為：SZD-1、SZD-2、SZD-3、SZD-4、SZD-5、SZD-6、SZD-8、SZD-9、SZD-10。菌株SZD-2、SZD-5、SZD-9及SZD-10保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為：CGMCC No.6891～6894。見表1。

3 討論

發酵法生產乳酸多采用乳酸菌，國內外目前研究較多的D-乳酸發酵菌種主要集中于乳桿菌屬和芽孢乳桿菌屬。產D-乳酸的乳酸桿菌有棒狀乳桿菌扭曲亞種、德氏乳桿菌德氏亞種、德氏乳桿菌印度亞種、德氏乳桿菌乳酸亞種、德氏乳桿菌保加利亞亞種、美洲豹乳桿菌及詹氏乳桿菌等，產D-乳酸的芽孢乳桿菌有菊糖芽孢乳桿菌、納卡氏芽孢乳桿菌納卡亞種及土生芽孢乳桿菌等，但上述菌種中缺乏產高光學純度D-乳酸的野生菌株[3-5]。Manome等[6]對19種乳酸桿菌發酵葡萄糖所產D-乳酸的光學純度進行了檢測，其中產D-乳酸光學純度最高的為棒狀乳桿菌扭曲亞種（模式菌株NRIC 1051），D-乳酸光學純度為84.4%。Antonio等[7]用棒狀乳桿菌扭曲亞種（模式菌株DSM 20004）發酵葡萄糖，所產D-乳酸光學純度為93.2%～97.2%。丁子建等[8]用芽孢乳桿菌發酵葡萄糖，所產D-乳酸光學純度為96.04%。目前很少見到產D-乳酸光學純度為100%的野生菌株的文獻報道[9]，而我們從發酵食品中分離篩選出的9株SZD菌株產D-乳酸的光學純度達100%，用自制淀粉培養體系發酵產D-乳酸濃度最高達57g/L，如將其應用于發酵生產D-乳酸，將有助于提高D-乳酸的產能并降低生產成本。因此，SZD菌株具有很大的研究價值和廣闊的應用前景，我們已對這些菌株申報了國家發明專利。

參考文獻：

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[7]Antonio GR， Pinelli D， Rossi M， et al. Production of l（+） and d（？） lactic acid isomers by Lactobacillus casei subsp. casei DSM 20011 and Lactobacillus coryniformis subsp. torquens DSM 20004 in continuous fermentation[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering，1996，81（6）：548-552.

[8]丁子建，柏中中，孫志浩，等. 芽孢乳桿菌發酵葡萄糖制備D（-）-乳酸的研究[J]. 生物加工過程，2004，2（3）：30-36.

[9]Tashiro Y， Kaneko W， Sun Y， et al. Continuous D-lactic acid production by a novel thermotolerant Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis QU 41[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2011， 89（6）： 1741-1750.

編輯/哈濤