PRF聯合nHA對犬牙槽嵴裂修復的動物實驗

摘要：目的 比較納米羥基磷灰石（nHA）配合富血小板纖維蛋白（ PRF）與單獨使用納米羥基磷灰石，對犬牙槽突裂的修復效果。方法 選取12只健康成年犬， 采用自身對照的方法。在全麻下拔除狗的上頜左右側門齒，模仿人體牙槽突裂，制作一寬4mm，長5mm，深6mm的楔形骨缺損區，關閉創口，喂養8w后，放入不同的填充材料，右側為實驗組， 填充nHA與PRF混合物，左側為對照組，填充PRF，分別于4、8、12w處死動物各4只， 獲取完整動物標本，行大體觀察及組織學染色檢查， 測量新生骨面積。結果 術后4、8、12w實驗組新生骨面積大于對照組，差異有統計學意義（ P<0.05）。結論 nHA與PRF配合，有促進牙槽突裂修復的作用。

關鍵詞：富血小板纖維蛋白；納米羥基磷灰石；牙槽突裂

牙槽突裂是唇裂畸形患者的常見并發癥，尤其是單側或雙側的完全性唇裂。修復牙槽突裂對于維持上頜骨連續性，促進頜骨發育，誘導恒牙萌出，改善發音有重要意義。對于如何增加骨量，解決患者牙槽突裂，成為當前的研究熱點。因此，本實驗建立狗的牙槽突裂模型，觀察不同的植入材料對牙槽突裂骨組織修復的效果，為臨床應用提供可靠資料。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇健康雜種狗12只，無全身及口腔疾病，4～5個月齡，體重12～14kg，雌雄不分，隨機分為三組，每組4只。

1.2試劑和器材 納米羥基磷灰石（遵義醫學院材料中心提供，孔隙率80% ，孔徑100～500μm）、BI2000 型圖像分析系統（中國四川） 等。

1.3方法

1.3.1 PRF的制備 采用一次離心的方法， 手術前用真空采血管采血15mL，立即在離心機上以3000r/min離心10min，得到上層的乏血小板血漿（platelet poor plasma， PPP），中間層的PRF與下層的紅細胞。棄掉上層液體，得到淡黃色凝膠狀PRF，用剪刀剪成1×2mm大小顆粒狀，與nHA按1：1比例混勻，備用。

1.3.2實驗方法 犬全身麻醉、側臥固定、保持張口度，常規消毒、鋪巾。牙齦分離器分離犬上頜左右側門齒的牙齦，小心拔除。用高速渦輪機在拔牙窩處制作一寬4mm，長5mm，深6mm的楔形骨缺損區，建立牙槽突裂動物模型，關閉創口，喂養8w，再次手術，打開后放入不同的填充材料，右側為實驗組， 填充nHA與PRF混合物，左側為對照組，填充PRF，術后青霉素肌注3d預防感染。分別于4、8、12w處死動物各4只， 獲取完整動物標本，行大體觀察及組織學染色檢查， 測量新生骨面積。

1.4觀察指標

1.4.1組織學檢查 在距種植體周骨缺損區 5mm處取材，經10%福爾馬林固定， 50mL/L硝酸脫鈣， 梯度酒精、丙酮脫水，石蠟包埋，連續切片，HE染色，光鏡觀察。

1.4.2新生骨定量分析 在每組各個時間段的同一部位隨機取3張組織學切片， 在光學顯微鏡下（*100）觀察新生骨生成情況， 采集圖像，導入計算機圖像分析系統， 每張切片采集上下左右及中心區共5 個視野， 測量每個視野下新生骨組織面積，計算與缺損重建區總面積的百分比，結果進行統計學分析。

1.5統計學處理 組織形態學數據采用 SPSS16.0軟件進行統計分析， 用配對 t檢驗對實驗組與對照組結果進行處理，計量資料以（x±s）表示，P<0.05表示有顯著差異。

2 結果

2.1大體觀察 所有犬均無死亡或炎性反應等并發癥發生。傷口愈合好，隨著時間的延長，牙槽嵴裂凹陷逐漸減小，同一時期中，實驗組傷口愈合比對照組更平實。

2.2組織學觀察 術后4w時，犬牙槽嵴裂處新骨開始生成， 實驗組大立方形成骨細胞覆蓋在已經形成的類骨質周圍，有大量成纖維細胞和毛細血管，少量淋巴細胞、破骨細胞、巨噬細胞和中性粒細胞，新生骨呈條索狀；對照組與之相似， 但纖維成分多、細胞成分少、毛細血管稀疏， 新生骨少，呈點狀分布。術后8w時，犬牙槽嵴裂處新骨形成活躍，實驗組新生骨粗大致密， 融合成網狀， 成骨細胞及血管依然較多，對照組成骨細胞及血管較少，新生骨稀疏較，排列不規則。術后12w犬牙槽嵴裂處的成骨細胞開始變為小，成為骨細胞，陷入骨基質中，新生骨開始礦化成熟，實驗組骨基質中骨細胞多而致密，新生骨融合成片，板狀骨開始出現；對照組的骨基質中骨細胞少，新生骨面積較小、分布不均，板狀骨少見。

2.3新生骨定量分析 術后4、8、12w實驗組新生骨面積百分比大于對照組， 兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表 1。

3 討論

修復牙槽突裂的骨移植材料，常用的有自體骨、異體骨、人工骨等。自體骨有不會產生免疫排斥反應，臨床效果好，是移植材料的\"金標準\"，但是常常有獲取量有限，塑性困難等缺點，患者也同時要忍受供骨區的手術，感染及并發癥風險[1]。異體骨則是尸體取骨或哺乳動物的骨無機化處理的產物，這類材料的優點在于來源于哺乳動物本身，生物相容性好，無排斥反應及抗原性，不傳播疾病等；缺點是生物降解不易調控，加工困難，來源有限，價格昂貴，吸收時間不確定等，應用受到一定限制[2]。人工材料有納米羥基磷灰石、磷酸三鈣等，這類材料克服了異體骨的缺點，具有可塑性高、吸收穩定、加工容易、可按需要調整孔隙大小、價格便宜等特點，同時納米羥基磷灰石還具有以下特性：有良好的生物相容性，無毒無害，能在短時間內與機體軟硬組織緊密結合；在形態、晶體結構和結晶度上與人體骨組織和牙組織的磷灰石相似，有類似的物理化學性質，在本實驗中發揮對牙槽骨裂隙區的支撐作用；有良好的可降解性，其孔隙率達80%～90%，6個月降解率為80%[3]，本實驗中，nHA恰好在骨形成穩定時，達到大部分的降解，但它缺乏骨誘導性。

理想的牙槽突裂修復材料除了需要具有在一定時間內的可吸收性和生物相容性外，還需要有良好的骨誘導性。富血小板纖維蛋白（PRF）是具有立體網絡結構的纖維蛋白，含豐富的血小板和多種生長因子，其與富血小板血漿（PRP）相比，最大的優勢在于制作方法更為簡便，僅僅需要一次離心；不需要添加任何抗凝劑和激活劑，更為安全，影響因素更少，同時還有以下特性： PRF含有大量未充分激活的含有Q顆粒的血小板。 PRF的蛋白立體網絡結構可以與血小板形成的生理性結合，可以相對延長生長因子的作用時間。 PRF內存在的高濃度的白細胞，有利于減少術后腫脹和疼痛。因此，PRF具有骨誘導性，但其單獨使用時吸收速度偏快，且彈性膜的量較天然骨低。

本研究通過nHA與PRF聯合使用，充分發揮兩種材料的特性，觀察其成骨效果。術后4w時，PRF的生長因子促進了細胞的增殖分化，nHA/PRF組的成骨細胞及新生骨組織比nHA組更多；術后8w時，PRF的纖維蛋白柔韌多孔的三維空間結構為組織細胞的遷徙、增殖、分化提供了有利的場所，也更有利于毛細血管的長入及穩定，因此實驗組有更強的成骨能力；術后12w，PRF利于間充質干細胞的遷入、粘附和分化及骨細胞的形成，所以，nHA/PRF組的新骨形成的量及成熟度均高于nHA組。因此，nHA/PRF復合物分別在術后 4、8、12w獲得良好的成骨效果，是良好的牙槽突裂修復材料，但其具體的作用機制還需要更深入的研究。

參考文獻：

[1]Yücel S， Aydin I， zimen D， et al. Effect of simulated body fluid on the behaviour of artificial bone composite material extended by hydroxyapatite and silicate powders [J]. Key Eng Mater， 2012， 493-494：159-165.

[2]廖世波， 賴琛， 張志雄， 等. 骨修復復合材料及其相關問題的研究進展[J].中國生物醫學工程學報， 2012， 31（5）： 755-761.

[3]閆永發，王春蘭，范月靜. 納米羥基磷灰石復合膠原植入術治療牙周病骨缺損的療效觀察[J].中華臨床醫師雜志，2011，5（1）：239-240.編輯/哈濤