陰道局部HBD-2及LL-37濃度及基因表達與RVVC發病的關系

摘要：目的 通過檢測RVVC陰道局部HBD-2、LL-37的蛋白濃度及基因表達，探討其與RVVC發病的關系。方法 選取我院門診RVVC28例，VVC30例，健康體檢者30例，Elisa法檢測陰道灌洗液上清HBD-2、LL-37蛋白濃度，熒光定量PCR檢測灌洗液沉淀脫落細胞HBD-2、LL-37的mRNA水平。結果 ①VVC組HBD-2、LL-37的蛋白濃度顯著高于對照組及RVVC組；RVVC組HBD-2、LL-37的蛋白濃度較對照組降低。②VVC組HBD-2、LL-37的mRNA水平高于對照組，RVVC組HBD-2、LL-37的mRNA水平低于對照組。結論 HBD-2、LL-37參與陰道局部抗感染的固有免疫過程；HBD-2、LL-37的低表達可能是RVVC反復發作原因之一。

關鍵詞：復發性外陰陰道假絲酵母菌病；HBD-2；LL-37; PCR

外陰陰道假絲酵母菌病（vulovaginal candidiasis，VVC）是女性多發病。抗真菌藥的廣泛使用并沒有使該病發病率下降，VVC發病率約占所有外陰陰道炎中的39%，居第一[1]。5%~10%的患者反復發作，成為復發性外陰陰道假絲酵母菌病（recurent vulovaginal candidiasis， RVVC）。研究表明[2]，RVVC發病與患者陰道局部免疫功能異常有重要相關性。人防御素2（HBD-2）及抗菌肽LL-37是人固有免疫系統的重要成分。本研究通過測定RVVC患者局部兩種因子的濃度及基因水平，探討陰道局部固有免疫與RVVC發病的關系，為今后其免疫治療提供依據。

1資料與方法

1.1 一般資料選取2012.6~2013.1河北聯合大學附屬醫院婦科門診就診及健康體檢的婦女為研究對象，分三組。RVVC組28例，VVC組30例，對照組30例。排除標準：妊娠婦女，合并BV、滴蟲，近一個月使用陰道局部抗真菌藥，血性分泌物。

診斷標準：VVC：初發或偶發，有典型體征，鏡檢見菌絲，真菌培養為假絲酵母菌；RVVC：VVC經治療體征消失，真菌學查陰性后又出現癥狀，1年內發作4次及以上，真菌培養為假絲酵母菌；對照組為分泌物檢查正常的婦女。

1.2 標本收集采集標本獲患者知情同意。以3ml生理鹽水沖洗陰道上段及宮頸，后穹窿處抽取灌洗液，3000轉/分離心5min。收集于EP管，用于Elisa實驗；沉淀細胞成分收集于另一EP管，用于提取脫落細胞總mRNA。標本于-20℃凍存。

1.3 試劑及儀器實驗完成于河北聯合大學實驗中心。人源HBD-2、人源LL-37 Elisa試劑盒，兩步法熒光定量反轉錄PCR試劑盒均購自廣州綠色醫藥科技有限公司；RotorGene 3000 PCR儀，ELX800uv酶標儀，高速離心機，Q3000型微量分光光度計，引物由Invitrogen公司設計合成。

1.4 方法

1.4.1 按照Elisa試劑盒說明書操作，標準品蛋白濃度做縱坐標，標準品測OD值做橫坐標，繪制標準曲線得到回歸方程，計算標本蛋白濃度。

1.4.2 將陰道脫落細胞成分融化，加入1ml trizol冰上裂解，按說明書提取各標本總mRNA。及反轉錄合成cDNA，反應條件為42℃，50 min。cDNA凍存于-80℃冰箱。用PCR儀進行PCR擴增，擴增體系20μL。反應條件：95℃，15 s；59℃，25 s；共45個循環。實驗結果應用分析軟件Rotor-Gene計算出2-ΔΔCt值即各標本mRNA相對含量。

1.5 統計學方法使用SPSS17.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，總體分析采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Elisa檢測HBD-2、LL-37蛋白水平RVVC組的HBD-2、LL-37濃度較對照組明顯降低（P＜0.05）；VVC組的HBD-2、LL-37含量較對照組均升高（P＜0.05）。以上差異均有統計學意義。見表1。

2.2 HBD-2、LL-37 mRNA水平結果RVVC組陰道脫落細胞的HBD-2 mRNA、LL-37 mRNA的水平比正常對照組均明顯降低（P＜0.01）；而VVC組陰道脫落細胞的HBD-2 mRNA水平較對照組升高（P＜0.05），LL-37 mRNA水平較正常對照組顯著升高（P＜0.01）。見表2。

3 討論

陰道固有免疫系統是陰道抵抗外界各種病原的第一道防線，陰道粘膜分泌的抗微生物多肽是固有免疫系統的重要組成部分[3]，它是內源性、有抗菌活性的陽離子短肽，其主要包括防御素家族和Cathelicidins家族。而HBD-2和LL-37分別是這兩個家族的代表多肽。

防御素廣泛存在于口腔、支氣管和生殖道等，已明確其有廣譜、高效抗菌活性。HBD-2除可直接抗白假絲酵母菌外，還可誘導產生趨化因子IFN-γ、IL-10從而激活細胞免疫反應。劉朝暉[4]等發現，白假絲酵母菌接觸體外培養的陰道上皮細胞后能以時間依賴的形式刺激其分泌HBD-2，提示陰道上皮細胞是陰道局部產生HBD-2的重要來源。本研究中，VVC組HBD-2的蛋白濃度和mRNA水平較對照組明顯升高，提示了陰道局部分泌HBD-2參與了抑制白假絲酵母菌過度繁殖的過程。而正常對照組中也檢測到了HBD-2，推測是由于假絲酵母菌是條件致病菌，以孢子相少量持續存在，陰道局部表達少量HBD-2以維持其正常微生態環境。以上結果表明，VVC發病時，HBD-2表達增強以促進對致病菌的清除。而RVVC組HBD-2的蛋白濃度和mRNA的表達低于對照組及VVC組，可能與RVVC患者陰道局部固有免疫機制異常有關，陰道局部合成分泌HBD-2的能力不足。

LL-37的殺菌機制是通過在真菌表面形成膜離子通道而致其死亡。研究說明，LL-37具有抗白假絲酵母菌的作用。VVC組LL-37的蛋白濃度及mRNA水平均高于對照組，說明當白假絲酵母菌致病時陰道局部通過分泌LL-37抑制白假絲酵母菌。而RVVC組較對照組及VVC組的LL-37表達水平均較低，說明其陰道局部固有免疫的反應能力下降，而不足以對抗白假絲酵母菌的致病，也許是RVVC反復發作不愈原因之一。

本研究從蛋白及基因水平檢測了RVVC及VVC患者HBD-2及LL-37的水平。發現當白假絲酵母菌大量侵襲陰道粘膜時，能夠誘導陰道局部HBD-2、LL-37高表達，從而起到抑制其侵襲的作用，可見HBD-2、LL-37參與了陰道局部的固有免疫反應；而RVVC組的低表達表明其陰道局部固有免疫機制異常，抵抗白假絲酵母菌的能力降低，這可能是其反復發作的原因之一。由VVC患者HBD-2、LL-37的高表達及RVVC患者HBD-2、LL-37的低表達可以推測，VVC的發病機制與RVVC可能不同，VVC的發病主要與陰道微環境失調有關，而RVVC發病主要與陰道局部免疫力低下有關。這提示我們，采用常規治療RVVC較VVC治愈率低和感染者陰道局部固有免疫力低下有密切關系，在抗真菌治療RVVC同時如能提高感染者局部免疫力，有望能提高RVVC的治愈率。

參考文獻：

[1]石一復. 外陰陰道疾病[M]. 人民衛生出版社， 2005.

[2]張岱，劉朝暉，廖秦平.下生殖道感染患者陰道局部免疫狀態的研究[J].中華婦產科雜志， 2009.

[3] 鄧敏端，黃英源.復發性外陰陰道假絲酵母菌病患者陰道局部細胞免疫功能[J].中國婦幼保健， 2010.

[4]劉朝暉，陳磊.陰道上皮細胞先天性抗假絲酵母菌的作用研究[J].北京大學學報(醫學版)， 2008.編輯/許言