PCR在大樣本低概率細菌檢驗項目中的應用研究

摘要：目的 探討PCR技術應用于大樣本低概率細菌檢驗項目的效果。方法 抽取2012年1月~2013年12月，我院體檢者的肛拭樣品23070份，采用PCR技術聯合細菌培養、分離、生化檢驗以及血清鑒定進行細菌檢驗。結果 本組23070份樣品經PCR檢測顯示112份為陽性，陽性率為0.49%；PCR工作時間僅為傳統法的26.02%。結論 PCR作為大樣本低概率細菌檢驗的過篩手段具有重要應用價值。

關鍵詞：細菌檢驗；大樣本；PCR

在臨床大樣本低概率細菌檢驗項目中，由于檢測工作量較大，主觀人為因素對檢測結果具有較大的影響，導致陽性檢出率偏低，影響臨床診療工作的正常開展。本研究應用具有高敏感度和特異度的PCR技術作為大樣本低概率細菌檢驗項目的過篩試驗手段，檢測沙門菌陽性率，現報道如下：

1資料與方法

1.1一般資料隨機抽取2012年1月~2013年12月，我院接受體檢者的肛拭樣品23070份，其中，男性10250份，女性12820份，年齡20~58歲，平均為（29.3±5.1）歲。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器PCR擴增儀用TECHNE TC-512型擴增儀，數據分析采用Tanon GIS-2018型數碼凝膠成像分析系統。PCR試劑盒引物均選自寶生科技有限公司，均在有效期內，操作嚴格按照說明書進行。

1.2.2試劑培養基、WS瓊脂、診斷血清SF增菌液、雙糖管等相關培養基均選自上海市疾控中心提供，均在使用期限內，均嚴格按照說明書配置。根據沙門菌特有hilA基因，設計F及R引物，靶基因片段的長度為550bp。

1.3方法分別采用傳統培養分離鑒定法和PCR法進行細菌分離鑒定。傳統法為取肛拭SF菌常規培養，然后轉種于WS平板上，選擇可疑菌落，置入雙糖管中生化，然后進行血清凝集試驗。PCR法為取肛拭SF菌常規培養，每30份作為1個混合PCR樣品，進行PCR技術進行陽性篩查。篩查為陽性的SF菌則轉種于WS平板上，選擇可疑菌落，置入雙糖管中生化，然后進行血清凝集試驗。PCR檢測過程如下：

1.3.1 DNA模板制備以棉拭子蘸滿增菌液，每30份作為1組，分別置入15ml無菌生理鹽水中進行充分混勻，然后精確量取1ml加入1.5ml的離心管中，在15000r/min下離心分離5min，棄上清液，然后加入100μl低滲溶液，置于100℃高溫下進行裂解10min，然后再次離心分離，取上清液，即為模板。

1.3.2 PCR擴增反應以（1.5mmol/L MgCl+20pmol引物F+0.2mmol/L dNTPs+20mmol/L Tris-Hcl+0.5% TrionX-100+50mmol/L Kcl+5%甘油）引物混合液20μl、模板3μl以及Taq酶1μl共計25μl作為反應體系。在94℃下進行5min預變性處理，然后在94℃下變性處理30s，改為55℃處理30s，在72℃下處理60s，重復上述循環35次，然后在72℃下進行延伸處理5min。最后以含有0.5μg/ml溴化乙錠溶液的2%瓊脂糖凝膠進行電泳，采用數碼凝膠成像系統對電泳結果進行分析。

1.3.3 PCR結果分析對于PCR呈陰性的樣品判定為陰性，對于PCR呈陽性的樣品，將其混合樣品接種于WS平安上，37℃下培養18~24h，然后選擇可疑菌落進行分離鑒定。

2結果

2.1 PCR篩查結果本組23070份肛拭樣品按照30份為一組分為769組，經PCR檢驗顯示112組為陽性，陽性率為14.56%。

2.2沙門菌陽性檢出率112組經PCR法檢測為陽性樣品中，共檢出37株沙門菌，共分布在32組樣品中，檢出率為28.57%（32/112）。其中，2組檢出3株沙門菌，1組檢出2株沙門菌，其余29組各檢出1株沙門菌。沙門菌陽性檢出率為0.16%（37/23070）。2012年全年44247份樣品中共檢出43株，檢出率為0.097%，檢出率差異顯著。

2.3時間效率比較PCR法檢出112組陽性標本，每組30份，共接種平板數3360塊，而傳統法23070份樣品均接種，接種數為23070塊。假設每塊平板接種時間為2min，則傳統法耗時共計46140min，為769h，以7h作為1個工作日，由1人完成工作約需要109.9d。而PCR法3360塊平板接種耗時共計6720min（112h）共計16d。PCR法較傳統法顯著縮短，見表1。

3討論

在大樣本低概率細菌檢驗項目中，由于工作強度較大，耗時較長，檢測結果極易受檢測人員的主觀因素影響較大。應用傳統方法檢測沙門菌，進行平板分離培養以后，需要密切觀察菌落形態變化，稍有疏忽即可發生漏檢，影響臨床診斷及治療結果[1]。

PCR法具有檢測速度快、靈敏度高以及自動化等特點，應用于大樣本篩查能夠減少工作人員的工作量。但PCR法具有一定的假陽性率，無法進行活菌定量檢測[2]。臨床研究證實，在沙門菌帶菌率檢測中應用PCR檢測相比于傳統方法更為快速、靈敏度更高，能夠快速排除陰性樣品，有效減少檢測人員的工作量，提高工作質量及工作效率[3]。本研究中，PCR法的工作時間約為傳統法的26.02%（28.6/109.9）。此外，PCR法的陽性檢出率為0.16%，相比于2012年同期的0.097%顯著提高。在769組樣品中，經PCR篩查陽性率為14.59%，而其中僅28.57%檢出存在沙門菌。可能是由于PCR篩查中存在一定的假陽性，或者在檢查過程中部分沙門菌死亡，或者因平板分離靈敏度較低，與PCR的高靈敏度不相協調，導致沙門菌未被檢測出。

綜上所述，PCR用于大批量低概率細菌檢驗項目可快速排出陰性樣本，針對少數陽性樣品實施平板分離鑒定，可提高工作效率，值得推廣應用。

參考文獻：

[1]呂治，彭國麗，蘇建榮，等.細菌16SrRNA基因PCR診斷細菌性陰道病的研究[J].首都醫科大學學報，2012，33(2):153-157.

[2]王一葉.比較PCR檢驗法和細菌培養法用于陰道細菌檢驗的效果[J].中外醫療，2013，32(24):192-193.

[3]李華鋒，陳英姿.應用PCR法與細菌培養法檢測陰道細菌的比較分析[J].中國保健營養（中旬刊），2012，(6):41-42.

編輯/許言