辣椒制品中羅丹明B的基質固相分散提取條件優化

韋 娜 ， 王 煜 ， 張孝芳 ， 馮敘橋 ， 齊小花 ， 鄒明強 *

（1.中國檢驗檢疫科學研究院 裝備技術研究所，北京 100123；2.沈陽農業大學 食品學院，遼寧 沈陽 110161；3.國家認可中心，北京 100062）

羅丹明B（Rhodamine B），又稱四乙基羅丹明，堿性玫瑰精，玫瑰紅B，俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，屬于咕噸系列的衍生物[1]。縮寫為RhB，分子式為C28H31ClN2O3，相對分子質量為479.017 5，其結構式見圖1。羅丹明B易溶于水和乙醇等有機溶劑，呈玫瑰紅色溶液，稀釋后有強烈的熒光產生，微溶于鹽酸和氫氧化鈉溶液。因其顏色鮮亮，價格便宜，許多不法商販將其加入到辣椒面和辣椒油等辣椒制品中以達到顏色的效果。中國衛生部將羅丹明B列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中，禁止在食品中使用[2]。

圖1 羅丹明B的結構Fig.1 Structure of rhodamine B

目前，檢測辣椒制品中羅丹明B的國家標準尚未出臺，而只有一些地方標準和行業標準[3]。據文獻報道，檢測羅丹明B所采用的樣品前處理方式也多為液液萃取或固相萃取[4-5]，所需的有機溶劑種類多、調配復雜，實驗所需耗材多、成本高。本實驗中采用改進后的基質固相分散萃取技術，針對具有代表性的3種辣椒制品即辣椒面、辣椒油和辣椒醬進行正交試驗，選用分散劑種類、分散劑與樣品質量比、洗脫劑組成及洗脫劑用量作為優化因素[6-9]，確定前處理過程中的最佳條件，利用高效液相色譜法進行羅丹明B測定。

1 材料與方法

1.1 標準品與試劑

標準物質羅丹明B，Sigma公司產品，純度99.5%；乙腈，國藥北京化學試劑有限公司產品，色譜純；甲醇，國藥北京化學試劑有限公司產品，色譜純；甲酸，國藥北京化學試劑有限公司產品，分析純；C18填料，國藥北京化學試劑有限公司產品；弗羅里硅土，國藥北京化學試劑有限公司產品；中性氧化鋁，國藥北京化學試劑有限公司產品；硅膠，國藥北京化學試劑有限公司產品。

1.2 儀器與設備

BS224S電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司制造；MS1渦旋振蕩器，德國IKA公司制造；KQ-2500E超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司制造；3K30型離心機，北京賽多利斯儀器系統有限公司制造；MTN-2800D氮吹儀，天津安特賽恩斯儀器有限公司制造；玻璃研缽和杵，北京市宏捷成生物科技有限公司提供。

1.3 提取工藝

對傳統的基質固相分散萃取技術進行改進，將1 g加有羅丹明B標準品的辣椒制品置于玻璃研缽中，混合均勻，加入分散劑，用研棒充分研磨，研磨后移入試管中，加入洗脫劑，振搖均勻，超聲10 min進行充分洗脫，取提取液于45℃下氮吹濃縮至干，用乙腈將其復溶定容至1 mL，過0.22 μm有機濾膜。

1.4 標準曲線的制作

配制羅丹明B的標準溶液，質量濃度為0.01 μg/mL、 0.05 μg/mL、 0.2 μg/mL、 1 μg/mL、 5 μg/mL 和10 μg/mL，以相對應的質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

1.5 羅丹明B含量的測定條件

采用高效液相色譜法測定溶液中羅丹明B的含量。色譜柱：SB C18 4.6 mm×50 mm，1.8 μm；檢測波長550 nm；柱溫 35℃；進樣量 10 μL；體積流量1.0 mL/min；流動相：乙腈/質量分數0.2%甲酸溶液（體積比 65∶35）。

1.6 正交試驗設計

選擇分散劑種類、分散劑與樣品質量比、洗脫劑組成及洗脫劑用量作為研究因素，其中分散劑與洗脫劑的選用原則主要是相似相溶原理，在盡可能提取出樣品中目標物的同時盡量保留樣品中其他成分，避免這些成分對目標物檢測產生干擾。實驗最終以提取液中的羅丹明B萃取率為考察指標，通過L16（45）正交試驗，選出最佳的辣椒制品中羅丹明B的提取條件，因素水平表見表1。

表1 正交試驗設計Table 1 Orthogonal design

2 結果與分析

2.1 標準曲線

根據溶液中羅丹明B濃度與峰面積相對應的關系，繪制的標準曲線如圖2所示，得出的回歸方程為：y=116.252 4x+0.660 1，在 0.01～10 μg/mL 質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 9。

圖2 羅丹明B標準品溶液標準曲線Fig.2 Rhodamine B standard curve

2.2 正交試驗結果與討論

本實驗中考察了4個因素和4個水平，選擇L16（45）正交表，其中一列為空列。正交實驗設計及各個辣椒制品的實驗結果見表2—4。

由表2、表3和表4中對羅丹明B提取率的R值進行的分析，可以得出影響羅丹明B提取率的因素大小關系為：D>A>B>C，洗脫劑的選擇影響作用最大，分散劑的選擇影響作用次之，洗脫劑的用量影響作用最小。根據各表中K值比較，確定辣椒面最佳的提取工藝條件為D3A4B3C2，即洗脫劑為質量分數80%的乙腈水溶液，分散劑硅膠，分散劑與樣品質量比例1∶1，洗脫劑體積20 mL；辣椒油最佳的提取工藝條件為D4A3B1C2，洗脫劑為體積分數80%的甲醇水溶液，分散劑中性氧化鋁，分散劑與樣品質量比例2∶1，洗脫劑體積20 mL；辣椒醬最佳提取工藝條件為D3A3B2C4，洗脫劑為質量分數80%的乙腈水溶液，分散劑為中性氧化鋁，分散劑與樣品質量比例3∶1，洗脫劑體積5 mL。前兩種辣椒制品的最佳洗脫劑體積均為考察范圍內的最大值20 mL，通過進一步研究，增加洗脫劑體積對羅丹明B的萃取沒有更大貢獻，所以考慮到實驗成本及環保，最終選擇20 mL最宜。

表5、表6和表7更深入地分析了4個因素對實驗結果的影響程度，從3個表中可以看出，洗脫劑和分散劑的選擇對實驗結果影響顯著，其次分散劑與樣品質量比例的影響較前兩者弱，洗脫劑的用量對實驗結果影響最不顯著，各因素對實驗結果的影響顯著性依次為：因素D （洗脫劑組成）>因素A（分散劑種類）>因素B（分散劑與樣品質量比例）>因素C（洗脫劑用量），此方差分析結果與極差分析結果一致。

2.3 實驗結果驗證與討論

通過對正交試驗結果的極差與方差分析確定的辣椒面的最佳組合為A4B3C2D3，即分散劑硅膠，分散劑與樣品質量比例1∶1，洗脫劑用量20 mL，洗脫劑選擇質量分數80%的乙腈水溶液；辣椒油的最佳組合為A3B1C2D4，即分散劑為中性氧化鋁，分散劑與樣品質量比例2∶1，洗脫劑用量20 mL，洗脫劑為體積分數80%的甲醇水溶液；辣椒醬的最佳組合是A3B2C4D3，即分散劑為中性氧化鋁，分散劑與樣品質量比例3∶1，洗脫劑用量5 mL，洗脫劑用質量分數80%的乙腈水溶液。將這3種代表性的辣椒制品的空白樣中分別添加質量濃度為100 μg/mL的羅丹明B標準溶液，使樣品中目標物質的質量濃度分別為 0.2 μg/mL、1 μg/mL 和 5 μg/mL， 按照分別的前處理最優條件對每個樣品的每一質量濃度進行5次檢測，最后取平均值，經由標準曲線計算得到各溶液中羅丹明B的濃度。經計算目標物回收率在80.6%～100.8%（見表8），可以達到痕量分析的要求。

表2 辣椒面樣品正交實驗表及結果Table 2 Orthogonal results of Chili Powder

表3 辣椒油樣品正交實驗表及結果Table 3 Orthogonal results of Pepper Oil

續表3

表4 辣椒醬樣品正交實驗表及結果Table 4 Orthogonal results of Chili Paste

續表4

表5 辣椒面樣品正交實驗方差分析Table 5 Orthogonal analysis of variance of Chili Powder

表6 辣椒油樣品正交實驗方差分析Table 6 Orthogonal analysis of variance of Pepper Oil

表7 辣椒醬樣品正交實驗方差分析Table 7 Orthogonal analysis of variance of Chili Paste

表8 辣椒樣品中羅丹明B回收率Table8 Recovery of Rhodamine B in Chili sample

3 結語

利用改進后的基質固相分散技術的正交試驗，進行辣椒制品中羅丹明B的提取工藝的研究，并對實驗結果進行極差和方差分析，得到最優提取工藝條件，如表9所示。

表9 辣椒樣品中羅丹明B最優提取條件Table 9 Optimal extraction conditions of Rhodamine B in Chili sample

同時對實驗結果進行驗證，確定在各自的最優條件下，3種辣椒產品中羅丹明B的最高提取率分別為：辣椒面100.8%，辣椒油99.7%，辣椒醬98.3%。

實驗操作簡單，有機溶劑種類少，只用到了乙腈和甲醇，改進后省去了固相萃取小柱，避免了在液液萃取或固相萃取過程中，可能由于所用有機溶劑復雜，或萃取小柱批次不同而導致的實驗結果不穩定，或目標物殘留在柱上等會影響目標物回收率的情況產生，并且節省了實驗成本。

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