極低頻交變磁場對過氧化氫酶活性的影響

薛麗萍 ， 孟亞萍 ， 趙娟娟 ， 楊 哪 ， 徐學明 *，2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

過氧化氫酶（Catalase，CAT）可以催化 H2O2分解成H2O和O2，廣泛存在于動物、植物和微生物體內。該酶結構中特殊的鐵卟啉環是其主要的活性中心[1]。過氧化氫酶不僅是生物演化過程中建立起來的生物防御系統的關鍵酶之一，并在食品、醫藥、紡織、造紙、環保等行業具有重要的應用[1-2]。對于許多帶金屬活性中心基團的酶，其運動方向會在磁場作用下發生變化，并且洛侖茲力會使拉默半徑發生改變，從而導致大分子構相發生扭曲或變形，最終改變酶的活性，細胞正常的生理活動也會受到影響[3]。Haberditzl W首次報道了在非勻強磁場的作用下，過氧化氫酶的酶活發生可預估的增加，這可能是一種繼發效應，即順磁性氧被加速從反應部位移除[4]。Vainer L M等在1978年報道了靜磁場暴露下對過氧化氫酶和[Fe3+（EDTA）]2催化H2O2分解速率的影響，當磁場強度達到0.8 T時，過氧化氫酶和 [Fe3+（EDTA）]2的催化速率分別提高了（20±5）%和（24±5）%[5]。張軍等研究了強穩恒磁場對離體牛肝CAT構象的影響，過氧化氫酶經過0.23～0.61 T磁場處理，其紫外光譜和熒光光譜都出現了吸收峰的改變，同時酶活也有一定程度的增加[6]。目前，關于磁場對過氧化氫酶的影響的研究主要集中于脈沖磁場或者靜磁場，研究參數主要是磁場強度和脈沖數，而關于極低頻交變磁場對過氧化氫酶影響的研究較少。磁場是在一定空間區域內連續分布的矢量場，N、S極不斷的交替變化的磁場稱為交變磁場。極低頻磁場通常是指頻率在0～300 Hz之間的磁場[7]。而世界衛生組織（World Health Organization，WHO）則將頻率在0～100 kHz之間的磁場統稱為極低頻磁場[8]。

作者所在課題組采用通電螺線管產生的交變磁場對過氧化氫酶進行處理，考察了不同溫度、頻率、pH、磁場強度及時間對過氧化氫酶的活性和二級結構的影響，初步探討極低頻交變磁場對過氧化氫酶的作用機理。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

過氧化氫酶 2 000～5 000 U/mg Protein，Sigma進口分裝；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、過氧化氫（質量分數30%）、去離子水，國產。

1.2 儀器與設備

螺線管極低頻交變磁場處理裝置，作者自行研制；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計、恒溫水浴鍋、MOS-450型AF-CD圓二色光譜儀，法國Biologic公司制造；AL204型電子天平、特斯拉計，國產。

1.3 實驗方法

1.3.1 極低頻交變磁場試驗環境 極低頻交變磁場采用變頻電源生成35～400 Hz、最大功率2 000 W的正弦波，信號電流經限流電阻并激勵螺線管，生成低頻交變磁場。樣品置于雙螺線管中心，且溫度由恒溫循環水浴控制，裝置如圖1所示。交變磁場強度由HT108型特斯拉計的縱向傳感器檢測，交變磁場頻率分別為 50、100、200、400 Hz； 磁場強度分別為 200、300、400、500 mT。

圖1 極低頻交變磁場裝置示意圖Fig.1 Extremely low frequency alternating magnetic field devices

1.3.2 酶活測定 將過氧化氫酶液放入極低頻磁場中處理一定時間后測定酶活，以相同溫度、相同時間且未經過磁場處理的酶液作為對照。酶活測定方法參考Beers and Sizers方法并進行改進[9]。反應池：1 cm石英比色皿，1 mL質量分數0.18%過氧化氫 （溶于0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液），0.1 mL酶液（溶于0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液），1 mL去離子水，以去離子水為參比?；旌锨胺謩e在25℃水浴中保溫5 min。底物與酶液混合后立即在240 nm波長下測定吸光度變化，每10 s記錄一次吸光度A，根據酶反應動力學曲線最初直線段的斜率（△A/t）計算酶活力。在1 min內引起吸光度增加0.001所需的酶量為一個酶活單位（以U/min表示）。相對酶活的計算如式（1）。

1.3.3 不同磁場條件對過氧化氫酶酶活的影響

1）不同磁場暴露時間：固定溫度為25℃，酶液pH 7.0，磁場強度 200 mT，磁場頻率 50 Hz，磁化時間分別為 0.5、1、2、4、6、8 h。

2）不同磁場強度：固定溫度為25℃，酶液pH 7.0，磁化時間8 h，磁場頻率50 Hz，磁場強度分別為200、300、400、500 mT。

3）不同交變頻率：固定溫度為25℃，酶液pH 7.0，磁場強度200 mT，磁化時間8 h，磁場頻率分別為50、100、200、400 Hz。

4）不同溫度：固定酶液pH 7.0，磁場強度200 mT，磁化時間8 h，磁場頻率50 Hz，溫度分別為25、35、45、55 ℃。

5）不同酶液 pH：固定溫度為 25℃，時間 8 h，磁場強度200 mT，磁場頻率50 Hz，酶液pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0。

1.3.4 二級結構測定 將過氧化氫酶溶液在不同的磁場環境中暴露2 h，以未進行磁化處理的酶液作為對照樣，通過圓二色譜儀測定，石英樣品池的光程為0.1 cm，掃描速度1 nm/s，過氧化氫酶質量濃度為 0.1 mg/mL，測定波長范圍為 190～250 nm，圓二色譜數據為3次掃描平均值。

2 結果與分析

2.1 磁場暴露時間對過氧化氫酶的影響

從圖2可以看出，不論是否經過磁場暴露，實驗體系下過氧化氫酶的酶活都隨著時間的增加逐漸下降，并且呈現一定的波動。在磁場強度200 mT，磁場頻率50 Hz的條件下，酶活在前2 h下降速度較快，而4 h處小幅上升，之后又緩慢下降。而對照組的酶活下降趨勢則較為平緩。從相對酶活的變化趨勢可以看出，前1 h的相對酶活都在100%以上，說明在此磁場條件下可以造成酶活提高。此后相對酶活的下降速度較快，同時在4 h處出現了波動。本實驗結果與劉勇等[10]報道的研究結果有相似之處，即0.15、0.30、0.45 T磁場處理后酶活性降低比較緩慢，并在開始一段時間內酶活性明顯增大。本研究中酶活降低的速率大于對照樣品且波動較大，這可能是由于本實驗中采用了極低頻交變磁場，在環境體系中會造成帶電蛋白質表面形成不同方向的感應電流，產生安培力而造成蛋白質空間構象變化[11]。而已有的文獻報道，采用穩恒磁場和靜態磁化法，對酶的作用力較小。

圖2 過氧化氫酶在磁場處理不同時間的酶活和相對酶活變化Fig.2 Effect of time on the specific and relative enzyme activity of catalase under magnetic field

2.2 磁場強度對過氧化氫酶的影響

從圖3可以看出，不同磁場強度下，酶活都呈現下降趨勢，但變化趨勢不一。總體上，隨著磁場強度的增加，酶活下降速率增加。可以看出，在前1 h，500 mT磁場下酶活和相對酶活的下降速率最大，但同時此磁場條件下相對酶活出現了較大波動，從2 h處的47.26%增加到4 h處的73.06%，可能是因為過氧化氫酶在較強的磁場強度下，側鏈形狀發生了變化，從而產生了不同的變化趨勢。

同時，相對酶活的變化趨勢波動性更大，說明磁場強度可以更大程度地改變酶的結構。酶活性隨磁場改變的無規律性是磁場改變酶活性效應的一個特征，反映了磁場對酶的作用是高度非線性的生物學過程。酶的磁效應極其復雜，影響因素眾多，“非線性”的表象正是其非線性作用本質規律的反映[12]。

圖3 過氧化氫酶在不同磁場強度下的酶活和相對變化Fig.3 Effect of the magnetic field intensity on the specific and relative enzyme activity of catalase

2.3 交變頻率對過氧化氫酶酶活的影響

從圖4可以看出，在不同交變頻率下酶活和相對酶活都呈現下降趨勢且不同頻率下酶活減小的速率不同。隨著頻率的增加，酶活減小的程度放緩。50 Hz頻率下的酶活始終大于其他3種轉速下的酶活。100 Hz下前2 h，酶活較高，相對酶活為102.84%，暴露4 h后則急劇減小到28.24%。200 Hz和400 Hz下酶活變化大體相同，都維持在較低的數值。說明頻率升高會影響酶的活性，尤其是較高的頻率會抑制酶活。頻率越高在蛋白質表面感應的環形分子電流頻率就越高，相鄰蛋白質之間或蛋白質內部產生的交變安培力可能對其酶活有較大的影響。

圖4 過氧化氫酶在不同磁場頻率下的酶活和相對酶活變化Fig.4 Effect of the magnetic field frequency on the specific and relative enzyme activity of catalase

2.4 磁場暴露下溫度對過氧化氫酶酶活的影響

從圖5中可以發現，在實驗的4個不同溫度下，酶活的變化趨勢基本相同，酶活隨著時間的增加逐漸減小，同時在2～4 h之間出現了波動，與前面所述時間變化趨勢大體相似。25℃條件下酶活始終高于其他條件下的，35℃和45℃條件下酶活大小交替增加，55℃下酶活始終處于較低的狀態。張軍[13]等對4℃和25℃、0.23 T磁場處理下離體過氧化氫酶研究發現，相同磁場在處理溫度不同的條件下，引起的磁效應是不相同的，并且影響效應隨溫度的增加趨于顯著。

與此同時，可以發現25、35、45℃的相對酶活變化趨勢相差不大，只是減少的程度不同，這可能是過氧化氫酶的最適溫度不同造成的。而55℃的變化趨勢卻和前三者差異巨大，55℃條件下相對酶活急劇增加，最高點為相同時間、溫度下對照酶活的2 142.86%，由于過氧化氫酶在55℃放置8 h已經完全失活酶活值為0，故8 h處相對酶活無法計算。究其原因，可能是因為極低頻磁場和高溫共同作用下較大程度地改變了過氧化氫酶的結構，使其更加趨于穩定，獲得較好的相對耐高溫特性。這個推論將在后面的實驗中進一步驗證。

圖5 過氧化氫酶在不同溫度下的酶活和相對酶活變化Fig.5 Effect of temperature on the specific and relative enzyme activity of catalase

2.5 酶液pH對過氧化氫酶酶活的影響

從圖6看出，pH影響酶活變化的趨勢較為明朗，且與之前所述變化趨勢大體一致。由于過氧化氫酶的最適pH是7.0，故最適pH周圍酶活較高，而在pH 5情況下酶活受到抑制，故酶活較低。相對酶活的變化趨勢與酶活變化相似，說明在磁場條件相同時，對酶的影響因素主要是pH，而這也是酶活和相對酶活變化較為規律的原因。pH不同則酶表面所帶電荷量有差異，在交變磁場下于酶表面產生的感應電流大小有異則是對酶活造成影響的主要原因。

圖6 過氧化氫酶在不同pH下的酶活和相對酶活變化Fig.6 Effect of pH value on the specific and relative enzyme activity of catalase

2.6 磁場處理對二級結構的影響

圓二色譜法（CD）是最常用的分析蛋白質二級結構的方法，通過CD圖譜能分析計算α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲等各組分的含量。典型α-螺旋結構在 208、222 nm處有兩個負峰，典型β-折疊結構在216 nm處有一個負峰[14]。由于溫度和磁場強度對酶活影響較大，故選擇了25℃、200 mT，25℃、500 mT，55℃、200 mT 3個磁場條件進行CD遠紫外圖譜掃描，并且做了對照組的掃描。

從圖7可以看到，在25℃下不同的磁場條件對過氧化氫酶的二級結構有一定的影響，但是CD圖譜的形狀相差不大，可見二級結構差異不大。對照組的圓二色光譜圖中在209、215 nm處有兩個明顯負峰，表明過氧化氫酶的二級構象中同時存在α-螺旋和β-折疊結構，經過200、500 mT磁場處理后，過氧化氫酶的CD圖譜發生了一些變化，209和215nm處的負峰值略有上升，并且隨著磁場強度的增強，負峰值逐漸上升。

圖7 25℃下不同處理方式過氧化氫酶的圓二色譜Fig.7 CD spectra of catalase treated under 25℃at different conditions

從表1的數據可以看出，經過磁場處理，過氧化氫酶的α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲的含量都有不同程度的變化。磁場條件25℃、200 mT處理的酶液與對照相比，α-螺旋含量急劇減少，β-折疊含量略有增加，β-轉角含量增加，無規卷曲含量減少。磁場條件25℃、500 mT處理的酶液與對照相比，α-螺旋含量急劇減少，β-折疊略有增加，β-轉角含量減少，無規卷曲含量增加。

表1 25℃不同處理條件下過氧化氫酶的二級結構組成Table 1 Composition of catalase secondary structure on 25℃under different treatment conditions

在蛋白質二級結構中，α-螺旋和β-折疊均為有序結構，α-螺旋和β-折疊結構的增加將會增加酶的活性，反之減小則會減小酶的活性，因此又選擇了將α-螺旋和β-折疊總量作為一個參數來衡量酶二級結構變化。從表1中數據可以發現，經過磁場處理后α-螺旋和β-折疊的總量小于對照組，且磁場強度越大，含量越少，這與之前的酶活結果一致。

同樣，如圖8所示，55℃對照的CD光譜圖中也存在兩個負峰，分別在210、222 nm附近，表明二級構象中同時含有α-螺旋和β-折疊兩種結構。55℃磁場處理的過氧化氫酶CD光譜圖中210、224 nm的負峰值明顯上升，且圖譜形狀發生較大變化。

圖8 55℃下不同處理方式過氧化氫酶的圓二色譜Fig.8 CD spectra of catalase treated under 25℃at different conditions

見表 2，55℃、200 mT條件下與對照相比，α-螺旋含量增加，β-折疊含量減少，β-轉角含量減少，無規卷曲含量也減少。由表2數據可知，55℃磁場處理后α-螺旋和β-折疊的總量大于對照組，且酶的二級結構整體上有向α-螺旋轉化的趨勢，因而提高了酶的活性。

表2 55℃不同處理條件下過氧化氫酶的二級結構組成Table 2 Composition of catalase secondary structure on 55℃under different treatment conditions

綜合以上結果說明，在55℃、200 mT的磁場條件下，過氧化氫酶的二級結構發生了較大變化，這也與之前酶活變化的結果吻合。故而推測過氧化氫酶在此極端條件下形成了具有相對耐高溫的結構。

同時可以看到，經過磁場暴露處理后，無論是25℃還是55℃，過氧化氫酶的二級結構各組分含量差別不大，但是跟對照樣品相比，各組分含量都有一定的變化，尤其是55℃條件下。這說明可能55℃、200 mT磁場會促使過氧化氫酶形成某種穩定結構來抵抗外界條件的變化。

另外，由于過氧化氫酶的活性中心鐵卟啉環存在高自旋的Fe3+，25℃、200 mT，25℃、500 mT和55℃、200 mT 3種磁場對其的擾動會影響酶的活性。由于蛋白質分子的主鏈較為穩固，而側鏈具有較大的柔性，有自由運動的能力。由此推測可能在25℃、200mT，25℃、500 mT和55℃、200 mT 3種磁場的作用下側鏈發生了一定程度的扭轉，形成了新的分布取向，從而改變了二級結構各組分的數量。溫度升高，酶的構象逐漸從鈍化態轉為活化態，其側鏈的運動自由度也增加[6]。溫度越高，磁場對側鏈分布的影響就越大，這也可能是55℃磁場處理后過氧化氫酶二級結構與對照樣品相差較大的原因。同時，猜測高自旋的Fe3+很可能是一個主要的推動力。由此推測磁場處理后過氧化氫酶的三級結構可能也有較大變化，而文獻也有類似報道[3]，具體的情況還有待進一步研究。

3 結語

1） 過氧化氫酶在 25～55 ℃、200～500 mT、50～400 Hz磁場處理下酶活隨著時間延長而出現不同程度的降低，并且伴有波動。

2）不同磁場處理條件對過氧化氫酶的相對酶活影響程度不同，其中頻率、pH對相對酶活的影響較為平緩且有規律性，溫度和磁場強度對相對酶活的影響比較復雜，并且在55℃、200 mT條件下，形成了具有相對耐高溫的結構。過氧化氫酶的二級結構CD圖譜顯示，55℃磁場處理后過氧化氫酶的α-螺旋和β-折疊的總量大于對照組，這與相對酶活變化的結果吻合。

[1]Schrader M，Fahimi H D.Peroxisomes and oxidative stress[J].Biochimica et Biophysica Acta （BBA）：Molecular Cell Research，2006，1763（12）：1755-1766.

[2]Zamocky M，Furtmuller P G，Obinger C.Evolution of catalases from bacteria to humans[J].Antioxidants and Redox Signaling，2008，10（9）：1527-1548.

[3]金江濤．脈沖磁場對草莓汁的殺菌鈍酶效果的影響[D].廣州：華南理工大學，2010.

[4]Haberditzl W.Enzyme activity in high magnetic fields[J].Nature，1967（213）：72-73.

[5]Vainer L M，Podoplelov A V，Leshina T V，et al.Effect of a magnetic field on the rate of H2O2breakdown by catalase and by an Fe3+-EDTA complex[J].Biophysics：Biofizika，1978（23）：234-242.

[6]張軍，孫凡，陳德萬，等．強穩恒磁場對離體牛肝過氧化氫酶構象及活力的影響[J].中國醫學物理學雜志，2001，18：35-36，53.ZHANG Jun，SUN Fan，CHEN Dewan，et al.Studies of biological effects of high indensities static magnetic fields on the conformation and activity of vitro catalase in bovine liver[J].Chinese Journal of Medical Physics，2001，18：35-36，53. （in Chinese）

[7]Otto M，von Muhlendahl K E.Electromagnetic fields（EMF）：Do they play a role in children’s environmental health（CEH）[J].Int J Hyg Environ Health，2007，210（5）：635-644.

[8]WHO （World Health Organization） Extremely low frequency fields.Environmental Health Criteria Monograph No.238[M].Geneva：World Health Organization，2007.

[9]施特爾馬赫．酶的測定方法[M].錢嘉淵 譯.北京：中國輕工業出版社，1992.

[10]劉勇，賈紹義，吳松海．不同磁場對過氧化氫酶活性及酶促反應的影響[J].天津大學學報，2009，42（10）：897-900.LIU Yong，JIA Shaoyi，WU Songhai.Effects of different magnetic fields on activity of catalase and enzymatic reaction[J].Journal of Tianjin University，2009，42（10）：897-900.（in Chinese）

[11]李梅，曲久輝，彭永臻．脈沖磁場水處理技術在殺菌、滅藻方面的研究[J].環境科學學報，2004，24（2）：260-264.LI Mei，QU Jiuhui，PENG Yongzhen.Sterilization and algae killing by the application of pulsed magnetic field[J].Acta Scientiae Circumstantiae，2004，24（2）：260-264.（in Chinese）

[12]高夢祥，胡翠翠，嚴奉偉，等．磁場和抑制劑對蓮藕多酚氧化酶反應動力學的影響[J].農業機械學報，2008，39（1）：78-81.GAO Mengxiang，HU Cuicui，YAN Fengwei，et al.Effect on reaction dynamics of lotus root polyphenol-oxidase by inhibitors and magnetic field[J].Tansactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery，2008，39（1）：78-81.（in Chinese）

[13]張軍，孫凡，陳德萬，等．0.23 T穩恒磁場對不同溫度離體牛肝過氧化氫酶的磁效應研究[J].激光生物學報，2001，10（3）：191-194.ZHANG Jun，SUN Fan，CHEN Dewan，et al.Effect of 0.23 T steady magnetic field on catalase in different temperature[J].Acta Laser Biology Sinica，2001，10（3）：191-194.（in Chinese）

[14]上官麗娟，馬永昆，崔鳳杰，等．高壓處理對辣根過氧化物酶活性及構象的影響[J].高壓物理學報，2011，25（5）：475-480.SHANGGUAN Lijuan，MA Yongkun，CUI Fengjie，et al.Effects of high pressure processing on the activity and the conformation of horseradish peroxidase[J].Chinese Journal of High Pressure Physics，2011，25（5）：475-479.（in Chinese）