微生態制劑對仔豬生長性能及腸道菌群的影響

王 娜 ， 商志偉 ， 趙 敏

（1.東北林業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江民族職業學院 學生工作部，黑龍江 哈爾濱150066；3.黑龍江民族職業學院 食品工程系，黑龍江 哈爾濱 150066）

近年來，關于動物腸道微生態的研究日益受到人們重視。一方面，人們試圖從腸道微生態角度尋求作為動物促生長劑——抗生素的替代品[1]；另一方面，動物腸道被認為是人腸道研究的理想模型[2]。而能夠調控動物腸道微生物平衡、增殖有益菌、抑制有害菌，從而提高動物健康水平的微生態制劑（probiotics）[3]正日益受到人們的關注。有研究報道，合理利用微生態制劑，可以有效地減少仔豬斷奶應激的發生，仔豬飼喂微生態制劑后，其可有效定植在仔豬腸道內[4]，能提高動物腸道中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性[5]，并能夠調節腸道菌群，使在仔豬腸道中對宿主健康起有益作用的細菌數量大幅提高［6］，還可以有效抑制致病菌的生長，維持腸道正常的生態平衡[7-8]，預防和治療仔豬腹瀉[9]。此外，其無殘留、無毒副作用等特點，可改善養殖生態環境，使養殖生產良性發展，取得更好的經濟效益和生態效益[10]。動物腸道環境不斷變化，并且受多種因素影響，在益生菌的配制方面，一般認為混合菌制劑有益于微生物間的互補，效果較好。Collado等[11]將幾種不同乳酸菌進行了復配，并對其腸道抑菌效果進行了試驗。結果表明，混合菌株的效果好于單獨菌株。Sanders等［12］研究不同益生菌屬、種和菌株對宿主的益生作用，也發現復合的菌株或菌種比單一菌株更有效。

在本研究中，作者首次將蠟樣芽孢桿菌、戊糖乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等進行混合，通過飼喂斷奶仔豬，研究其對仔豬生長性能的影響，再進一步研究微生態制劑在仔豬腸道定植情況及其對腸道菌群的影響，旨在深入了解微生態制劑對斷奶仔豬生長可能的調控機制，為菌種的合理搭配和復合微生物制劑的生產應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 微生態制劑

蠟樣芽孢桿菌，由作者所在試驗室從健康斷奶仔豬糞便中分離并鑒定，現存于東北林業大學微生物實驗室；鼠李糖乳桿菌（CICC6159）、戊糖乳桿菌（CICC 21809），購置于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

戊糖乳桿菌培養基配方為：1 g/dL乳糖+廢糖蜜，0.5 g/dL棉粕粉，0.3 g/dL磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉；蠟樣芽孢桿菌培養基為：0.5 g/dL蔗糖+0.5 g/dL廢糖蜜，1 g/dL棉粕粉，0.3 g/dL氯化鈉；鼠李糖乳桿菌培養基配方為：1 g/dL乳糖+廢糖蜜，0.5 g/dL棉粕粉，0.3 g/dL磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉。

分別發酵戊糖乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌，將發酵液以8 000 g離心10 min得菌泥，向菌泥中加入質量分數5%葡萄糖溶液作為保護劑，再拌入適量滅菌干燥的稻殼粉（3種益生菌活菌數≧1×1010cfu/g），低溫干燥，得活菌制劑，檢測 3種活菌制劑活菌數（活菌數≧1×109cfu/g）后備用，將制備好的3種菌制劑以1∶1∶1體積比例混合即得混合微生態制劑。

1.2 飼養管理及動物試驗

試驗于大慶市泰康縣康泰公司種豬場進行，選用 28 日齡，初始平均體質量為（8.20±0.22）kg 的“杜長 大”三元雜交健康（無腹瀉）斷奶仔豬24頭，仔豬隨機分為兩組（對照組和試驗組），每組4個重復，每個重復3頭仔豬。以玉米-豆粕型日糧，營養需要參照英瑞斯企業標準設計（表1），飼料為粉料。對照組飼喂正常粉料，試驗組采用粉料拌食質量分數0.1%混合微生態菌制劑（飼料活菌數≧1×109cfu/kg）為日糧。試驗期為63 d（試驗組飼喂微生態制劑56 d+飼喂正常粉料 7 d），每日 8∶00、13∶00、19∶00 喂食，自由飲水；每次飼喂直至料槽剩余少許飼料為止，準確記錄每日每個重復組仔豬日供料量、剩余料量和損失料量，每7 d對兩組仔豬逐只空腹稱質量。試驗期間，每日8∶00定時觀察仔豬糞便情況（是否存在糞質稀薄，水分增加，或含未消化食物或膿血、黏液）。記錄腹瀉頭數及次數，計算腹瀉率。腹瀉率=（總腹瀉次數/（總頭數×試驗天數））×100%。

表1 基礎日糧配方及營養水平Table 1 Basic diet formula and nutrition levels

1.3 糞便收集

試驗期間，每7 d一次于晨8∶00對各重復組仔豬逐只直腸取便少許 （約10 g），立刻放入無菌管中，于-80℃冰箱保存，備用。

1.4 糞樣中pH值測定

分別取不同時間點備用糞樣2 g，加入l0 mL蒸餾水，混勻后靜置5 min，用酸度計測定pH值。

1.5 PCR法檢測仔豬糞便益生菌相對含量

1.5.1 細菌基因組提取及引物設計 分別取不同時間點備用糞樣2 g，放入組織粉碎機中磨碎，加5 mL無菌磷酸緩沖液稀釋，充分混勻，取2 mL勻漿，采用solarbio細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌種基因組DNA。在GenBank上查找蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌菌株的16S rDNA序列，然后利用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）設計屬內特異性引物，上下游引物序列見表2。

表2 蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌特異性引物Table 2 Primer sequences for genes in Bacillus cereus，Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus pentosus

1.5.2 PCR法檢測樣品糞便蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌相對含量 PCR程序參考陳津津[13]等方法并加以改進：10×PCR Buffer，25 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPS， 上下游引物 0.2 （μmol/L）/0.2（μmol/L），DNA模板1μL，1.25UTaq酶（Promega）；反應條件：94℃變性3 min；循環35次；94℃變性40 s，55℃退火20 s，72℃延伸 75 s；72℃延伸5 min。

1.6 DGGE分析微生態制劑對仔豬腸道菌群的影響

選取斷奶當天，斷奶后7、14、21、28 d和63 d收集的兩組仔豬糞樣供DNA提取，方法同上。

利用一對細菌通用的引物 F933-954：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC GGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG -3’，R1369-1388：5’-GCCCGGGAACGTATTCACCG-3’對細菌的16S rDNA的V6—V8區片段進行PCR反應[14]。DGGE用質量分數8%聚丙烯酰胺凝膠，尿素質量分數梯度30%～50%，電泳緩沖液為0.5×TAE，先200 V恒壓電壓預電泳10 min，隨后在85 V電壓電泳10～12 h。電泳結束后，用銀染法進行染色，顯色定影后干燥過夜，觀察染色效果并照相。

將DGGE凝膠圖譜上的特殊條帶進行回收，以8 f和1 510 r[15]作為PCR引物用于引導細菌16S rDNA全序列的擴增，然后將PCR產物進行膠回收，與PMD-18T質粒連接，轉化至大腸桿菌感受態中，將轉化成功的質粒進行測序，序列的同源性通過互聯網與GenBank數據庫進行比較。

1．7 數據統計與處理

所有數據應用SPSS 13.0統計軟件進行方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 微生態制劑對仔豬生長性能的影響

仔豬斷奶時由于環境、飼料、消化生理和免疫等因素的改變，易使斷奶仔豬產生應激反應，出現消化吸收功能異常，消化道正常微生物區系紊亂，導致腹瀉和生長發育受阻[16]。由表3可知，喂食微生態制劑可以促進仔豬的生長，降低料質量比和腹瀉率。在喂食微生態制劑前兩周時，與對照組相比，試驗組仔豬頭平均日增質量增加35%，平均料質量比降低9.04%，腹瀉率下降37.04%；喂食3～4周時，仔豬頭平均日增質量增加26.32%，平均料質量比降低7.7%，腹瀉率下降26.32%；喂食5～8周時，頭平均日增質量增加10.71%，平均料質量比降低7.7%，腹瀉率下降12.03%。說明微生態制劑對仔豬生產性能的影響具有顯著的時間效應，在仔豬斷奶初期微生態制劑對仔豬的影響最顯著。

本研究中，飼喂混合微生態菌制劑2周后頭平均日增質量增加35%，平均料質量比降低9.04%，腹瀉率下降37.04%，與黃麗彬[17]和王海東[18]等研究相比較，此混合微生態菌制劑效果更佳，這可能是由于本微生態制劑中的菌種間發生協調作用，相互促進各自在腸道內的有益作用，使其益生效果更加明顯。

2.2 微生態制劑對仔豬糞樣pH值的影響

通常認為，糞便的pH值可部分反映動物消化道中的酸堿程度。pH值偏酸，反映消化道環境有利于有益微生物的生長，而偏堿則反映對有害微生物有利，產生腹瀉的概率較大[19]。

由圖1可知，試驗期間，由于斷奶的影響，在對照組中，仔豬糞便pH呈現先上升后下降趨勢，直到35 d后pH值才逐漸恢復到斷奶當日水平。試驗組仔豬糞樣pH始終較對照組低，且基本保持在斷奶水平。

表3 微生態制劑對仔豬生長性能的影響Table 3 Effents of compound probiotic on growth performance of weaning piglet

圖1 微生態制劑對仔豬糞便pH值的影響Fig.1 Effents of compound probiotic on pH of weaning pigle

圖1說明，通過飼喂本微生態制劑使仔豬消化道保持偏酸性環境，可利于有益微生物的生長。有研究表明，腸道中的酸性環境有利于營養物質的消化吸收，可提高飼料利用率，這點恰好與微生態制劑促進仔豬生長性能相吻合。

2.3 糞便中3種目標益生菌相對含量變化分析

研究表明，對糞便微生物數量的動態監測可以反映目標益生菌在腸道內定植過程的演變規律[20]。圖 2（a）（b）（c）各為飼喂微生態菌制劑后跟蹤檢測3種目標益生菌——蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌于仔豬體內相對于斷奶當日變化情況。結果表明，由于斷奶的影響，對照組中兩種乳酸桿菌在仔豬斷奶初期顯著降低，而試驗組中3目標菌數量均明顯高于對照組，隨喂食時間的延長試驗組中3種目標菌在腸道內的含量有增加的趨勢，并且在停喂一周后，糞樣中仍存在此3種益生菌，且數量較飼喂時無明顯變化。說明，在飼喂8周后微生態制劑中益生菌已成功定植到仔豬消化道中，可以幫助減緩斷奶時仔豬消化道內乳酸菌的變化，維持其腸道的穩定性。

圖2 仔豬糞便中3種益生菌隨時間變化情況Fig.2 Changes of Bacillus cereus，Lactobacillus rhamnosus，and Lactobacillus pentosus on flora in weanling piglets over time

有研究表明，益生菌進入動物體內可通過定植繁殖來維持消化道有益菌的優勢作用，并與腸道中的病原菌及潛在的致病菌競爭營養物質，從而抑制有害菌的生長[21-22]，提高機體的抗應激能力[23]，進一步促進仔豬的生長。

2.4 微生物制劑對斷奶仔豬腸道菌群的影響

利用DGGE技術對斷奶仔豬糞樣菌群進行跟蹤研究，結果見圖3，并將特殊條帶摳膠測序，見表4。

圖3 仔豬糞樣細菌16S rDNA的V6-V8區擴增產物的DGGE圖譜Fig.3 Bacterial DGGE profiles generated from V6-V8 16S rDNA fragments of piglets fecal samples

結果表明，蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌均存在于飼喂益生菌的仔豬糞樣中，且此3益生菌數量顯著高于對照組，這與qPCR結果相一致，再次說明3種益生菌成功定植在仔豬腸道內。并且，本微生態制劑可以通過增加宿主腸道益生菌（X1、X5、X6、X7、X12和X13）的數量及減少有害菌（X9和X10）的方式來調節腸道功能。如蠟樣芽孢桿菌X1，是一種兼性厭氧菌，可以在腸道內短時間定植，消耗大量的氧，維持腸道厭氧環境，有益于厭氧的乳酸菌的生長；X6、X7和X13均為乳酸菌，眾所周知，乳酸菌是動物腸道中常見的益生菌，其在抑制動物腸道有害細菌的生長繁殖，抵抗病原茵的感染，代謝產生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有機酸，刺激腸道蠕動，抑制腸道腐敗，提高抗病能力等方面，都有著重要的作用。所以認為，添加本微生態制劑可創造出有利于乳酸菌生長繁殖的環境，通過增殖腸道益生菌的數量來調節仔豬腸道菌群的平衡，進而緩解仔豬斷奶應激反應及促進仔豬生長。

表4 圖3中DGGE圖譜中特異性條帶的16S rDNA序列分析及物種鑒定Table4 16S rDNA sequenceanalysisand species identification ofselected dominant DGGE bands in Fig.3

3 結語

在本文所述試驗條件下，飼喂微生態制劑可以通過在仔豬消化道內定植益生菌來增加斷奶仔豬日增質量，降低料質量比和腹瀉率，維持仔豬腸道中pH值的穩定，促進腸道益生菌的生長繁殖，抑制有害菌的生長；并且，此微生態制劑對仔豬生長性能的影響有時間效應，在仔豬斷奶初期效果最佳。

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