黃嘌呤氧化酶酶學性質及共價交聯固定化

張玉然， 辛 瑜， 楊海麟， 張 玲， 王 武

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD），屬黃素蛋白酶類，可將次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，繼續氧化黃嘌呤為尿酸，并產生過氧化氫及超氧化物[1]，是嘌呤代謝的關建酶。可用于檢測血清無機磷、血清超氧化物岐化酶活力及胞外黃嘌呤、次黃嘌呤水平[2-4]。在核苷類藥物的合成中起到促進轉化的作用，可用于提高5-甲基尿苷、胸腺嘧啶核苷的合成產量[5-6]。

不同生物來源的黃嘌呤氧化酶酶學性質具有差異性。來源于細菌的黃嘌呤氧化酶國內外研究較少，已報道黃嘌呤氧化酶的相對分子質量及亞基組成差異較大[7-9]，蛋白結構組成的差異將導致酶催化性能及穩定性的不同。

黃嘌呤氧化酶作為一種重要的氧化酶，其在醫學診斷及工業催化中有應用前景，酶較差的穩定性影響其直接應用。已報道的提高酶穩定性的方法主要有添加保護劑、蛋白質工程、固定化方法等。其中，固定化方法因具有可連續反應性、可重復利用性等優點，備受關注。可使用的固定化載體主要有聚丙烯酰胺[10]、殼聚糖[11-12]、醋酸纖維素薄膜[13]、樹脂[14]等。國內外關于黃嘌呤氧化酶穩定性研究，主要集中于改進溶液環境提高酶熱穩定性[15-16]，對其固定化研究相對較少。

前期經SDS-PAGE電泳分析知，節桿菌Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶含兩個亞基，相對分子質量約為100 000及35 000[17]，與已報道的黃嘌呤氧化酶均不相同。在此基礎上，作者對此黃嘌呤氧化酶的酶學性質進一步分析，并利用修飾的瓊脂糖介質及大孔陰離子交換樹脂固定化黃嘌呤氧化酶。提供有效增強黃嘌呤氧化酶穩定性的固定化方法，也為其它酶類的穩定性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

Arthrobacter M3：作者所在實驗室保藏菌種。

1.2 主要材料

黃嘌呤氧化酶標準品（相對分子質量160 000）：近岸蛋白質科技有限公司提供；大孔陰離子交換樹脂 （D201、201×4）， 浙江爭光實業股份有限公司提供；Sepharose 4B：通用電氣醫療中國有限公司提供；乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺（EDC）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司提供。

1.3 主要儀器

V1100D可見分光光度計：美譜達儀器有限公司產品；電熱恒溫水浴鍋：科輝儀器廠產品；蛋白電泳儀：美國BIO-RAD公司產品；pH計（PB-10型）：德國賽多利斯股份有限公司產品。

1.4 培養及純化方法

從固體平板挑取單菌落，接入種子培養液，30℃恒溫振蕩培養12 h。后將種子培養液按體積分數3%接種量接入60 mL （500 mL錐形瓶）發酵培養基，30℃、220 r/min培養20 h。菌液破壁離心后，取上清酶液進行純化，參考文獻[17]。純化后酶液經0.22 μm濾膜過濾，置于4℃保存備用。

1.5 XOD酶活測定方法

黃嘌呤氧化酶酶活測定方法詳見參考文獻[18]。酶活力單位定義：在37℃下，每分鐘形成1 μmol過氧化氫所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1.6 XOD酶學性質分析

1.6.1 凝膠過濾確定XOD相對分子質量 以商業化的黃嘌呤氧化酶（相對分子質量160 000）標準品為對照，利用安捷倫 SEC-5（7.5 mm×300 mm，5 μm）凝膠過濾柱測定XOD相對分子質量。測定條件：流動相 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0），流量 0.5 mL/min，進樣量 40 μL，檢測波長 280 nm。

1.6.2 酶的最適反應溫度及最適反應pH 取一定濃度的稀釋酶液，于25～52℃水浴條件下進行酶活力測定，以活力最高者為100%，計算不同溫度下相對酶活。另取一定濃度的稀釋酶液，于37℃、不同pH條件下（5.5～9.0）進行酶活力測定，以活力最高者為100%，計算不同pH條件下相對酶活。

1.6.3 金屬離子對酶活的影響 在pH 7.5酶液中加入不同金屬離子 （Ca2+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ag+、Hg2+），至終濃度為 2 mmol/L，混勻，測定各組酶活，以未加金屬離子的酶液酶活為100%，計算各組相對酶活。

1.7 XOD固定化方法比較

1.7.1 大孔陰離子交換樹脂固定化 分別稱取已預處理的201×4陰離子交換樹脂及D201大孔陰離子交換樹脂各1.0 g于10 mL離心管中，加入pH 7.5的酶液6 mL，4℃、100 r/min下振蕩固定化2 h。混合物8 000 g離心5 min，測定上清酶活。后用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌至無酶析出，測定洗滌液酶活性及固定化酶活力，計算固定化酶載量及酶活回收率。

將固定化的黃嘌呤氧化酶，置于50℃恒溫水浴，2 h后測定酶活力，各組以未加熱處理的固定化酶酶活為100%，計算各組固定化酶的相對酶活。

1.7.2 瓊脂糖介質的修飾及其固定化 參考文獻方法[19]，分別先將間隔臂甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸交聯于預處理的瓊脂糖介質上，3種修飾后的介質分別命名為瓊脂糖-甘氨酸介質 （Sepharose-Gly）、瓊脂糖-谷氨酸介質（Sepharose-Glu）、瓊脂糖-天冬氨酸介質（Sepharose-Asp）。稱取不同的羧基載體各1.0 g于10 mL離心管中，添加酶液，調節pH至6.5，加入EDC共價交聯固定化黃嘌呤氧化酶，4℃振蕩固定15 h，混合物8 000 g離心5 min，測定上清酶活。后用0.6 mol/L氯化鈉洗脫非共價交聯的酶，至洗脫液無酶析出，再用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，測定洗脫液、洗滌液酶活性及固定化酶活力，計算固定化酶載量及酶活回收率。

將各修飾的瓊脂糖固定化酶置于50℃恒溫水浴，2 h后測定酶活力，各組以未加熱處理的固定化酶酶活為100%，計算各組固定化酶的相對酶活。

1.8 固定化化酶與游離酶熱穩定性的比較

1.8.1 不同溫度下固定化酶與游離酶熱穩定性比較 將游離酶與固定化酶置于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）中，不同溫度下（25、35、45、55、65、75℃）保溫1 h，冷卻至4℃，測定各組酶活。以各組未做處理酶的酶活為100%，計算相對酶活。

1.8.2 固定化酶與游離酶最適穩定pH的比較 將酶液于不同 pH 條件下（5.5～8.5），50 ℃保溫 1 h，冷卻至4℃，測定各組酶活，各組以0 h時酶活為100%，計算相對酶活。

1.8.3 固定化酶與游離酶存儲穩定性的比較 將固定化酶與游離酶置于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）中，置于50℃恒溫水浴，定時取樣，冷卻至4℃，測定固定化酶與游離酶酶活力，各組以0 h時酶酶活為100%，計算各組不同時間處相對酶活。

2 結果與討論

2.1 XOD酶學性質分析

2.1.1 XOD相對分子量的確定 由前期研究SDSPAGE電泳測得，菌種Arthrobacter M3產的黃嘌呤氧化酶含兩個亞基，相對分子質量分別約為100 000及35 000[17]。由圖1凝膠過濾圖譜知，黃嘌呤氧化酶標準品（相對分子質量160 000）凝膠過濾出峰時間為11.64 min，Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶出峰時間則為11.98 min，即比黃嘌呤氧化酶標準品相對分子質量略小。綜合判定，節桿菌Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶為相對分子質量約135 000的異質二聚體蛋白。

圖1 XOD標準品與來自Arthrobacter M3的XOD凝膠過濾圖譜Fig.1 Elution profile of standards and the XOD from Arthrobacter M3 by size -exclusion chromatography

2.1.2 XOD的最適反應溫度及最適反應 pH溫度是影響酶反應效率的重要因素之一，一定范圍內提高反應溫度可加快反應速率。在25～52℃范圍內進行酶活力測定，結果見圖2。由圖2可知，37℃時測得XOD酶活力最高。

在不同pH值下進行酶酶活力測定，結果見圖3。該酶最適反應pH為7.5，溶液pH＜5.5或pH＞9.0時對酶活力測定影響較大。

2.1.3 金屬離子對酶活的影響 如表1所示，不同金屬離子對XOD酶活影響具有差異性。Mn2+對XOD活性具有激活作用，相對酶活提高35.6%，Co2+及Zn2+對XOD酶活具有一定抑制作用，相對酶活分別降低 21.1%和 67.8%，Cu2+、Ag+、Hg2+對 XOD 酶活具有致死作用，這可能是由于3種金屬離子作用于蛋白巰基，導致XOD變性失活。

圖2 溫度對XOD酶活力測定的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of XOD

圖3 pH對XOD酶活力測定的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of XOD

表1 不同金屬離子對XOD活性的影響Table 1 Effect of various metal ions on the activity of XOD

2.2 XOD固定化方法比較

由表2可知，黃嘌呤氧化酶經不同方法固定化后，其熱穩定性均不同程度的提高。

大孔陰離子交換樹脂固定化，D201樹脂的固定化效率優于201×4樹脂，這可能是由于D201樹脂為大孔陰離子交換樹脂，相比于普通201×4樹脂，其顆粒內縫隙孔徑較大，有利于蛋白及底物的進出。

修飾的瓊脂糖介質固定化，3種固定化酶中，瓊脂糖-谷氨酸介質固定化酶，酶活回收率及熱穩定性最佳，固定化酶載量稍低于瓊脂糖-甘氨酸介質固定化的酶。這可能是由于，谷氨酸含有兩個游離羧基，瓊脂糖-谷氨酸介質可多點交聯XOD，使固定化酶更加牢固，穩定性增加，這同時也可能引起底物進入酶催化中心受阻，使得固定化酶表觀酶活力（載量）下降。

綜合比較，修飾的瓊脂糖介質固定效果化優于大孔陰離子交換樹脂，D201及201×4為含苯乙烯-二乙烯苯骨架的離子交換樹脂，對XOD的固定化作用主要靠離子鍵及疏水相互作用。而修飾的瓊脂糖介質靠共價交聯的方法固定XOD，結合作用力強于D201及201×4樹脂，這可能致使其固定化效果優于D201及201×4樹脂。

表2 不同載體對XOD固定化的影響Table 2 Effect of different supports on immobilization of XOD

2.3 固定化酶與游離酶熱穩定性的比較

2.3.1 固定化酶與游離酶不同溫度下熱穩定性比較 由上述固定化結果可知，瓊脂糖-谷氨酸介質固定化效率最佳，因此對其與游離酶的熱穩定性性能進行比較。由圖4可知，不同溫度下保溫1 h，固定化的黃嘌呤氧化酶熱穩定均優于游離酶。75℃保溫1 h，游離酶已幾乎無酶活，瓊脂糖-谷氨酸固定化酶仍剩余22.1%。

2.3.2 固定化酶與游離酶最適穩定pH分析 由圖5可知，在 pH 5.5～8.5范圍內，50℃保溫 1 h，瓊脂糖-谷氨酸固定化酶剩余的相對酶活均高于45%，而游離酶在較低酸堿條件下加熱處理，酶活損失較大。pH 8.5下剩余的相對酶活僅為2.1%。由此可知，瓊脂糖-谷氨酸固定化酶比游離酶具有更強的酸堿抵抗能力。

圖4 不同溫度下游離酶與固定化酶熱穩定性比較Fig.4 Comparison of the stability between free and immobilized xanthineoxidaseunderdifferent temperatures

圖5 游離酶與固定化酶的pH穩定性Fig.5 pH stability of free and immobilized xanthine oxidase

2.3.3 固定化酶與游離酶存儲穩定性的比較 將瓊脂糖-谷氨酸固定化酶與游離酶置于50℃保溫，二者相對酶活隨時間變化曲線見圖6。由圖可知，游離酶放置3 h后，相對酶活僅剩余8.0%，而瓊脂糖-谷氨酸固定化酶仍剩余48.3%，半衰期由游離酶的0.84 h延長至固定化酶的2.2 h，提高了1.6倍。

圖6 固定化酶與游離酶存儲穩定性Fig.6 Storage stability of free and immobilized xanthine oxidase

3 結語

節桿菌Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶為含兩個不同亞基的異質二聚體，相對分子質量為135 000，與所報道文獻中均不同，其最適反應溫度為37℃，最反應pH為7.5。采用修飾的瓊脂糖介質及大孔陰離子交換樹脂對黃嘌呤氧化酶進行固定化，發現以修飾的瓊脂糖介質固定化的酶熱穩定性較好，其中以瓊脂糖-谷氨酸固定化的酶性能最佳，50℃下半衰期提高了1.6倍，有效提高了黃嘌呤氧化酶穩定性，為其在醫學診斷及工業催化中的穩定應用奠定基礎，后期將進一步探索改造黃嘌呤氧化酶穩定性的方法。

[1]Pritsos C A.Cellular distribution，metabolism and regulation of the xanthine oxidase enzyme system[J].Chem Boil Interact，2000，129：195-208.

[2]黎瑞珍，楊慶建，陳貽銳．超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定及其應用研究[J].瓊州大學學報，2004，1l：34-36.LI Ruizhen，YANG Qingjian，CHEN Yirui.Study of determination of superoxide dismutase （SOD） activation and application[J].Journal of Qiongzhou University，2004，11（5）：34-36.（in Chinese）

[3]Pei J H，Li X Y.Xanthine and hypoxanthine sensors based on xanthine oxidase immobilized on a CuPtCl6 chemically modified electrode and liquid chromatography electrochemical detection[J].Ana Chim Acta，2000，414（1）：205-213.

[4]胡紅焱，崔云龍，鄒德勇，等.黃嘌呤氧化酶比色法測定血清無機磷[J].中華醫學檢驗雜志，1998，2l（4）：214-216．HU Hongyan，CUI Yunlong，ZHOU Deyong，et al.A enzymatic method for the determination of inorganic phosphate in serum[J].Chinese Journal of Medical Laboratory Sciences，1998，21（4）：214-216.（in Chinese）

[5]孟疆輝，陳蔚梅．利用黃嘌呤氧化酶提高病毒唑轉化率[J]．武漢大學學報：自然科學版，1999，45（6）：838-840.MENG Jianghui，CHEN Weimei.Using xanthine oxidase to improve the productivity of Ribavirin （RBV）[J].Journal of Wuhan University：Natural Science Edition，1999，45（6）：838-840.（in Chinese）

[6]Bhushan B，Paquet L，Halasz A，et al.Mechanism of xanthine oxidase catalyzed biotransformation of HMX under anaerobic conditions[J].Biochem Biophy Res Commun，2003，306（2）：509-515.

[7]Thomas S，Annette R，Jan R A.Selenium-containing xanthine dehydrogenase from Eubacterium barkeri[J].Eur J Biochem，1999，264（3）：862-871.

[8]William T S，Thressa C S.Selenium-dependent metabolism of purines：A selenium-dependent purine hydroxylase and xanthine dehydrogenase were purified from Clostridium purinolyticum and characterized[J].Proc Natl Acad Sci，2000，97：7208-7213.

[9]Koenig K，Andreesen J R.Xanthine dehydrogenase and 2-furoyl-coenzyme A dehydrogenase from Pseudomonas putida Fu1：two molybdenum-containing dehydrogenases of novel structural composition[J].J Bacteriol，1990，172：5999-6009.

[10]黃蓓，孫建中，李偉，等.聚丙烯酰胺-聚乙二醇對L-天門冬酰胺酶的包埋研究[J].高校化學工程學報，2003，17（4）：431-437.（in Chinese）HUANG Bei，SUN Jianzhong，LI Wei，et al.Studies on immobilized L-asparaginase based on polyacrylamide and PEG[J].Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities，2003，17（4）：431-437.

[11]Kumar S，Dwevedi A，Kayastha A M.Immobilization of soybean （glycine max） urease on alginate and chitosan beads showing improved stability：analytical applications[J].J Mol Catal B：Enzym，2009，58（1-4）：138-145.

[12]蘇二正，夏濤，宛曉春，等.單寧酶和β-葡萄糖苷酶的共固定化[J].食品與生物技術學報，2006，25（1）：40-44.SU Erzheng，XIA Tao，WAN Xiaochun，et al.Studies on the co-immobilization of tannase and β-glucosidase[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2006，25（1）：40-44.（in Chinese）

[13]時敏，王雪，馬麗娜，等.醋酸纖維素-聚丙烯復合膜固定化轉谷氨酰胺酶的研究[J].食品科學，2013，34（9）：155-158.SHI Min，WANG Xue，MA Lina，et al.Cellulose acetate-polypropylene composite membrane immobilized phospholipase[J].Food Science，2013，34（9）：155-158.（in Chinese）

[14]虞英，蔣慧亮.離子交換樹脂吸附法固定化脂肪酶的研究[J].食品與生物技術學報，2007，26（4）：97-100.YU Ying，JIANG Huiliang.Study of lipase immobilization on the exchange resin by adsorption[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2007，26（4）：97-100.（in Chinese）

[15]Amini K，Sorouraddin M H，Rashidi M R.Activity and stability of rat liver xanthine oxidase in the presence of pyridine[J].Can J Chem，2011，89：1-7.

[16]李忠琴，許小平，王武.奶油黃嘌呤氧化酶的酶學性質研究[J].食品科學，2008，29（9）：420-422.LI Zhongqin，XU Xiaoping，WANG Wu.Study on characteristics of xanthine oxidase from milk cream[J].Food Science，2008，29（9）：420-422.（in Chinese）

[17]ZHANG Yuran，XIN Yu，YANG Hailin，et al.Novel affinity purification of xanthine oxidase from Arthrobacter M3[J].J Chromatogr B，2012，906：19-24.

[18]李忠琴，許小平，王武.辣根過氧化物酶分光光度法測定黃嘌呤氧化酶的活性[J].分析化學，2006，34（6）：821-824.LI Zhongqin，XU Xiaoping，WANG Wu.Spectrophotometic determination of activity of xanthine oxidase by horseradish peroxidase[J].Chinese journal of analytical chemistry，2006，34（6）：821-824.（in Chinese）

[19]XIN Yu，YANG Hailin，XIA Xiaole.Affinity purification of a cholesterol oxidase expressed in Escherichia coli[J].J Chromatogr B，2011，879：853-858.