魷魚墨黑色素鐵對缺鐵性貧血大鼠的影響

王芙蓉 ， 謝中國 ， 葉興乾 ， 鄧尚貴 ， 陳士國 *， 胡亞芹

（1.湖南文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2.浙江舟山普陀海洋高科技園區(qū)，浙江舟山316100；3.浙江大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，浙江 杭州 310029；4.浙江海洋學(xué)院 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000）

鐵是人體必需的一種營養(yǎng)素，在機(jī)體代謝過程中起著非常重要的作用，鐵在體內(nèi)參與血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素及某些酶的合成，體內(nèi)缺鐵時將引起一系列疾病[1]。鐵缺乏嚴(yán)重時會導(dǎo)致小細(xì)胞低色素性貧血即缺鐵性貧血（IDA）。IDA是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響人類健康的主要原因之一，也是世界衛(wèi)生組織（WHO）確認(rèn)的四大營養(yǎng)缺乏癥之一[2]。

鐵劑和鐵劑強(qiáng)化食品常被用來防治IDA，但是現(xiàn)有鐵制劑的吸收干擾因素較多，生物利用度非常低，并且對胃腸道產(chǎn)生較大刺激，強(qiáng)化的鐵劑往往導(dǎo)致食品中的脂質(zhì)氧化劣變等，不易為患者所接受。因此尋求更為安全和高效的補(bǔ)鐵制劑是當(dāng)前亟待解決的問題。

魷魚墨囊大約占魷魚體質(zhì)量的1.3%，魷魚墨主要成分為黑色素和蛋白多糖復(fù)合體，鮮墨汁中黑色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，屬于真黑色素。魷魚墨黑色素具有很強(qiáng)的陽離子螯合特性，它主要通過羧基和去質(zhì)子化羥基等陰離子起作用。黑色素與金屬離子的結(jié)合能夠起著保護(hù)細(xì)胞的功能。黑色素與金屬離子具有很強(qiáng)的螯合能力，特別是對于鐵離子的螯合，前期研究表明魷魚墨黑色素螯合鐵離子的能力可達(dá)1.37 mmol/g，遠(yuǎn)高于天然有機(jī)態(tài)食品中有機(jī)鐵的含量，利用魷魚墨黑色素螯合金屬離子的特性制備一種新型補(bǔ)鐵劑—黑色素鐵，利用魷魚墨黑色素制備出黑色素鐵，對于IDA的防治具有重大作用，對其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。作者通過大鼠缺鐵模型試驗(yàn)，研究魷魚墨黑色素鐵對缺鐵性貧血的影響，并探討其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

SD大鼠：購于上海斯萊克生物有限公司；血清鐵（SI）測定試劑盒、總鐵結(jié)合力（TIBC）測定試劑盒：購自南京建成生物工程研究所；鐵蛋白（SF）、促紅細(xì)胞生成素（EPO）和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（sTfR）測定試劑盒：購于美國R&D公司；紫外可見分光光度計(jì)：島津公司產(chǎn)品；原子吸收分光光度計(jì)：AA700型，美國Perkin Elmer公司產(chǎn)品。

1.2 魷魚墨黑色素鐵的制備

采用高速離心法對魷魚墨黑色素進(jìn)行分離，收集沉淀冷凍干燥后，即得黑色素純品。黑色素鐵的制備：配制一定濃度的FeCl3溶液，加入黑色素，置4℃攪拌24 h，離心收集沉淀，冷凍干燥后即得黑色素鐵。樣品以硝酸和高氯酸混合溶液消化后，采用原子吸收分光光度法測得其中鐵的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85 g/g。

1.3 動物分組與喂養(yǎng)

健康雄性 SD 大鼠 56只，體質(zhì)量（80±5） g，以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)喂養(yǎng)3 d。隨即分為7組，其中8只整個實(shí)驗(yàn)過程都飼喂正常飼料，另外48只喂缺鐵飼料，耗空28 d建造缺鐵性貧血模型。缺鐵飼料參照AIN-76飼料配方[3]，其中的礦物元素添加劑不添加鐵劑。缺鐵大鼠根據(jù)Hb含量隨機(jī)分為6組：缺鐵組、魷魚墨黑色素鐵低、中、高劑量組（劑量分別為6，12，18 mg/kg）FeCl3組（劑量為 6 mg/kg），F(xiàn)eSO4組（劑量為6 mg/kg）。缺鐵組和正常對照組灌胃等體積去離子水，共21 d。

動物飼養(yǎng)在不銹鋼籠中，環(huán)境溫度濕度恒定（（24±1）℃，（55±5）%），自由采食、自由飲用去離子水，光照12 h/d，實(shí)驗(yàn)過程避免鐵污染。灌胃結(jié)束后，56只大鼠分別用巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在大鼠深度麻醉狀態(tài)下剖開腹部，從腹主動脈取血10 mL左右，從中取一部分全血測定Hb，另一部分取血清測血清 SI、SF、EPO、sTfR、TIBC。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 血液指標(biāo)的測定 Hb的測定：氰化高鐵血紅蛋白法[4]；血清SI和TIBC：采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。SF、EPO和sTfR采用ELASA法測定。

1.4.2 肝臟和脾臟中鐵含量的測定 待測肝臟和脾臟樣品分別加硝酸8 mL和高氯酸2 mL緩緩加熱，待溶液變成無色時，蒸發(fā)余酸至近干，冷卻，定容，稀釋到合適的倍數(shù)后用美國Perkin Elmer公司AA700型火焰原子吸收分光光度計(jì)測定鐵含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS18.0軟件中的單因子方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 魷魚墨黑色素鐵對大鼠血紅蛋白的影響

魷魚墨黑色素鐵對大鼠Hb的影響見表1。造模前各組大鼠Hb含量無顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)過28 d的缺鐵造模，缺鐵組大鼠Hb含量均低于90 g/L，說明大鼠已經(jīng)處于缺鐵性貧血狀態(tài)。對缺鐵性貧血大鼠分別補(bǔ)充魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO421 d后，大鼠Hb含量已恢復(fù)正常，與缺鐵組比較差異顯著 （P＜0.05），與正常對照組比較差異不顯著（P＞0.05）。

表1 造模前、造模后及補(bǔ)鐵后各組大鼠血紅蛋白的含量Table 1 Hb content of rats before depletion，depletion and repletion

2.2 魷魚墨黑色素鐵對大鼠體質(zhì)量的影響

魷魚墨黑色素鐵對大鼠體質(zhì)量的影響見表2。造模前各組大鼠體質(zhì)量無顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)過28 d的缺鐵造模，缺鐵組大鼠體質(zhì)量低于正常對照組（P＜0.05）。對缺鐵性貧血大鼠分別補(bǔ)充魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO421 d后，補(bǔ)鐵組各組大鼠體質(zhì)量與缺鐵組比較差異顯著（P＜0.05），與正常對照組比較差異顯著（P＜0.05）。

表2 造模前、造模后及補(bǔ)鐵后各組大鼠的體質(zhì)量Table 2 Body weight changes of rats before depletion，depletion and repletion

2.3 魷魚墨黑色素鐵對大鼠臟器指數(shù)的影響

魷魚墨黑色素鐵對缺鐵性貧血大鼠臟器指數(shù)的影響見表3。魷魚墨黑色素鐵各劑量組、FeCl3組和FeSO4組大鼠心臟指數(shù)顯著低于缺鐵模型組（P＜0.05），但明顯高于對照組（P＜0.05）。

表3 魷魚墨黑色素鐵對缺鐵性貧血大鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of SM-Fe on organ indexs in IDA model rats

魷魚墨黑色素鐵各劑量組、FeCl3組、FeSO4組大鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)與缺鐵模型組比較差異不顯著（P＞0.05），與對照組比較差異不顯著（P＞0.05）。魷魚墨黑色素鐵各劑量組、FeCl3組、FeSO4組的大鼠腎臟指數(shù)與缺鐵模型組比較差異不顯著（P＞0.05），與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。

2.4 魷魚墨黑色素鐵對大鼠血清鐵、總鐵結(jié)合力、肝臟鐵和脾臟鐵的影響

魷魚墨黑色素鐵對缺鐵性貧血大鼠血清鐵、總鐵結(jié)合力、肝臟鐵和脾臟鐵的影響如表4。魷魚墨黑色素鐵各劑量組、FeCl3組和FeSO4組大鼠血清鐵SI與對照組比較差異不顯著（P＞0.05），與缺鐵模型組比較差異顯著（P＜0.05）。魷魚墨黑色素鐵各劑量組、FeCl3組和FeSO4組大鼠血清總鐵結(jié)合力與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），與缺鐵模型組比較差異顯著（P＜0.05）。魷魚墨黑色素鐵各劑量組、FeCl3組和FeSO4組大鼠肝臟鐵和脾臟鐵含量與對照組比較差異不顯著（P＞0.05），與缺鐵模型組比較差異顯著（P＜0.05）。

表4 魷魚墨黑色素鐵對缺鐵性貧血大鼠血清鐵、總鐵結(jié)合力、肝臟鐵和脾臟鐵的影響Table 4 Effect of SM-Fe on serum iron，TIBC，liver and spleen iron in IDA model rats

2.5 魷魚墨黑色素鐵對大鼠血清鐵蛋白、促紅細(xì)胞生成素和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的影響

魷魚墨黑色素鐵對缺鐵性貧血大鼠血清鐵蛋白、血紅細(xì)胞生成素和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的影響見表5。魷魚墨黑色素鐵各劑量組、FeCl3組和FeSO3組與缺鐵模型組比較可顯著提高大鼠血清SF和EPO（P＜0.05），但低于對照組（P＜0.05）。 魷魚墨黑色素鐵各劑量組、FeCl3組和FeSO4組與缺鐵模型組比較可顯著降低大鼠血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量（P＜0.05），但高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

缺鐵性貧血（IDA）是全世界常見病之一。通過對大鼠飼喂缺鐵飼料建立IDA模型，探討魷魚墨黑色素鐵對IDA的影響。飼喂缺鐵飼料28 d后，飼養(yǎng)缺鐵飼料的大鼠Hb含量低于90 g/L，說明已經(jīng)造模成功。通過對缺鐵性貧血大鼠補(bǔ)充魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO4可以使大鼠Hb恢復(fù)到正常水平，說明補(bǔ)充鐵劑可有效改善IDA。通過飼喂缺鐵飼料可引起大鼠體質(zhì)量的降低，補(bǔ)充鐵劑后體質(zhì)量仍然低于對照組，說明本實(shí)驗(yàn)中缺鐵可引起大鼠體質(zhì)量的降低并影響實(shí)驗(yàn)最后的體質(zhì)量，這與先前的報道一致[3，5]。

表5 魷魚墨黑色素鐵對缺鐵性貧血大鼠血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和血紅細(xì)胞生成素的影響Table 5 Effect of SM-Fe on serum ferritin，sTfR and EPO in IDA model rats

IDA大鼠具有相對更重的心臟和心臟比重，表明存在心肌肥厚[6]。同時，貧血大鼠與對照組比較可增加心臟重量和心肌細(xì)胞的大小[7]。試驗(yàn)中缺鐵性貧血模型組大鼠心臟指數(shù)顯著高于對照組，補(bǔ)充魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO4后的各組大鼠心臟指數(shù)高于對照組，但與缺鐵模型組比較差異不顯著。

鐵是合成Hb的必需成分，通常認(rèn)為鐵含量不足可引起Hb合成速度的減慢。飼喂缺鐵飼料引起大鼠Hb和血清鐵顯著降低表明血紅蛋白鐵的耗竭。通過補(bǔ)充鐵劑魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO4可以恢復(fù)大鼠Hb水平和血清鐵含量。

血清總鐵結(jié)合力（TIBC）是指能與血清中全部轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的最大鐵量。通過測定TIBC可以用來評價轉(zhuǎn)鐵蛋白被飽和的水平，從而評估鐵的吸收效果。TIBC偏高說明機(jī)體處于缺鐵狀態(tài)。缺鐵模型組大鼠血清TIBC明顯高于對照組，補(bǔ)充魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO4后大鼠TIBC低于缺鐵模型組。補(bǔ)充鐵劑后，動物在吸收利用鐵的過程中，由于體內(nèi)鐵含量升高，血清鐵含量增加，血紅蛋白含量上升，轉(zhuǎn)鐵蛋白合成量減少，血清TIBC降低[8]。血清TIBC越小，表明轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和程度越高，鐵的吸收利用效果更好。因此魷魚墨黑色素鐵比FeCl3和FeSO4的補(bǔ)鐵效果更好。

肝臟和脾臟是機(jī)體最主要的鐵儲存器官[9]。缺鐵性貧血模型組大鼠肝臟鐵和脾臟鐵明顯低于對照組和補(bǔ)鐵組，肝臟鐵和脾臟鐵含量降低說明機(jī)體內(nèi)儲存鐵的耗竭，通過補(bǔ)充鐵劑魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO4可以提高肝臟鐵和脾臟鐵含量，進(jìn)而提高機(jī)體鐵的儲存。

鐵蛋白是機(jī)體內(nèi)一種儲存鐵的高分子含鐵化合物，是體內(nèi)鐵貯備的主要形式之一，也是反映機(jī)體體內(nèi)鐵貯備的一個特異性指標(biāo)[10-11]。血清鐵蛋白含量可以反映機(jī)體鐵儲存水平，機(jī)體鐵貯備減少時，血清鐵蛋白也相應(yīng)降低。缺鐵時血清鐵蛋白含量低，補(bǔ)鐵時或缺鐵時，血清鐵蛋白含量變化很大[12]。當(dāng)機(jī)體不是處于炎癥狀態(tài)下時，血清鐵蛋白濃度可以有效反映機(jī)體儲存鐵的多少[13]。在本研究中，缺鐵模型組血清鐵蛋白含量明顯低于對照組，通過補(bǔ)充魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO4，可顯著提高血清鐵蛋白含量。

血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（sTfR）能準(zhǔn)確反映體內(nèi)鐵儲存狀態(tài)，一定程度上反映細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的數(shù)量，sTfR是循環(huán)于血清中的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體片段的一種形式，主要以轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物的形式存在于血清中。通過測定血清sTfR濃度可以對IDA進(jìn)行診斷[14-15]。循環(huán)中的sTfR與個體鐵儲存變化有所不同。血清sTfR含量在輕度鐵缺乏狀態(tài)下也能增加[16]。作者發(fā)現(xiàn)，缺鐵模型組大鼠sTfR含量顯著高于對照組。補(bǔ)充鐵劑魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO4后，可顯著降低血清sTfR水平。

促紅細(xì)胞生成素（EPO）是促進(jìn)紅細(xì)胞生成的一個重要因子，它可以刺激紅系爆式集落單位（BFUE）的增殖和紅系克隆形成單位（CFU-E）的分化，刺激紅系祖細(xì)胞和前體紅細(xì)胞的分裂，促使紅細(xì)胞的生成增多[17]。EPO的產(chǎn)生主要由氧依賴性反饋控制[18]。Hb是氧感受器，當(dāng)Hb合成受到抑制時，EPO生成減少，血液中的EPO濃度在貧血時非常低。研究發(fā)現(xiàn)，缺鐵模型組大鼠EPO含量明顯低于對照組，補(bǔ)充鐵劑魷魚墨黑色素鐵、FeCl3和FeSO4后，可增加Hb的合成，顯著促進(jìn)EPO生成，進(jìn)而促進(jìn)造血功能。

4 結(jié)語

用不同劑量的魷魚墨黑色素鐵灌胃缺鐵性貧血大鼠，可提高大鼠血紅蛋白含量，提高血清、肝臟和脾臟鐵含量、提高血清鐵蛋白和促紅細(xì)胞生成素含量，提高血清和肝臟抗氧化能力，降低血清總鐵結(jié)合力和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量，改善缺鐵性貧血，且比FeSO4和FeCl3補(bǔ)鐵效果更佳。

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