螺旋藻抗氧化肽的制備及其體外活性研究

歐 贇， 喬燕燕， 王維有， 候 凡， 王 宇， 任迪峰*， 魯 軍

（1.北京林業大學 生物科學與技術學院/北京市林業食品加工與安全重點實驗室，北京 100083；2.中國食品發酵工業研究院/北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100027；3.清華大學 玉泉醫院，北京 100049）

眾所周知，活性氧（Reactive Oxygen Species）如羥基自由基、氫過氧自由基等，是人體代謝的產物之一。ROS的增多會破壞DNA、蛋白質，酶等細胞分子，并導致癌癥、心血管疾病和糖尿病等嚴重的疾病[1]。同樣，油脂的氧化也會引起食品的腐敗變質。抗氧化劑通過抑制氧化酶的活性、消耗環境中的氧以及提供氫原子來阻斷活性氧和食品中油脂自動氧化的連鎖反應。

雖然許多人工合成抗氧化劑在相關疾病的防治中得到廣泛的使用，但是這些人工抑制劑如丁基羥基茴香醚（BHA）和特丁基對苯二酚（TBHQ）等，都無法避免地帶有潛在的毒副作用。食源性的蛋白質水解物所含的多肽具有天然的抗氧化活性，易吸收，而且沒有人工合成抗氧化劑的副作用[2]。鑒于天然抗氧化肽的優勢，近年來一些研究已經驗證了不同生物來源[3-5]的活性肽的抗氧化活性作用。

螺旋藻（Spirulina platensis）被譽為21世紀人類最理想的食品[6]，其富含蛋白質、β-胡蘿卜素、γ-亞麻酸、維生素E等營養成分[7]。同時，螺旋藻不僅包括8種人體必需氨基酸，還是目前已知植物中螺旋藻是蛋白質含量最高的一種[6]，因此，螺旋藻是獲得天然活性肽的潛在寶貴資源。

作者通過對螺旋藻粉凍融，超聲等預處理，優化木瓜蛋白酶解條件，并結合超濾、凝膠過濾層析等方法，從鈍頂螺旋藻的酶解液中分離、純化得到活性肽，并對其進行體外生物活性研究，從而為螺旋藻抗氧化肽的開發和用于抗氧化功能食品和生物制藥方面奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

鈍頂螺旋藻：北京林業大學螺旋藻研究所提供；牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶（純度99%）、L-半胱氨酸（分析純）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）標準品（純度99%）、總抗氧化能力檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所提供；抗壞血酸 （純度99%）、無水乙醇、乙二胺四乙酸、氯化鈉、無水硫酸銅、氫氧化鈉、三氯乙酸、2-氨基-2-（羥甲基）-1，3-丙二醇（Tris）、鹽酸、水楊酸、氨水均為分析純。

WFZ752型紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司產品；Heto PowerDry LL1500凍干機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品；FA1604N電子分析天平：上海精密儀器廠產品；Anke GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠產品；DSY-2-8電熱恒溫水浴鍋：北京國華醫療器械廠產品；層析柱：上海之信儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻藻藍蛋白的提取和質量分數測定螺旋藻粉20 g懸浮在160 mL蒸餾水中，在-18℃下緩慢冷凍，然后在25～30℃水浴解凍，反復5次，再用超聲波破碎3 min，使藻藍蛋白充分溶出。在6 000 g、4℃條件下離心30 min，離心后去除沉淀，收集蛋白上清液。

以牛血清白蛋白作為標準物，采用Bio-Rad Protein Assay Kit測定蛋白質質量分數[8]。上清液通過真空冷凍干燥，得到螺旋藻的蛋白粉，保存于4℃。

1.2.2 螺旋藻藻藍蛋白酶解條件優化 為了得到較高的多肽濃度，確定木瓜蛋白酶水解螺旋藻藻藍蛋白的最佳條件，根據預備實驗結果設計正交試驗方案，實驗因素水平見表1。

1.2.3 三氯乙酸（TCA）法測定多肽質量分數 參考魯偉等人[9]的方法進行測定。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.4 超濾 在30 mL底物質量濃度為2 g/dL的螺旋藻蛋白液中加入終濃度為2.0 mmol/L的乙二胺四乙酸、5.0 mmol/L L-半胱氨酸、300 mmol/L氯化鈉，并在1.2.2得到的最佳酶解條件進行酶解。

將酶解液在6 000 g、4℃條件下經截留相對分子質量（MWCO）為30 000的超濾膜過濾去除酶等大分子物質，然后濾液經過不同截留相對分子質量（MWCO 10 000、3 000）的超濾膜在 4 ℃、6 000 g下超濾，獲得具有不同相對分子質量的濾液，并按1.2.5中所介紹方法測定各部分濾液的體外抗氧化活性，濾液真空冷凍干燥后在4℃下保存。

1.2.5 抗氧化活性研究

1）清除DPPH自由基能力 參考Kim S Y等人[10]的方法進行測定。

2）清除羥基自由基能力 參考李超等人[11]的方法進行測定。

3）總抗氧化能力 參照總抗氧化能力檢測試劑盒 （南京建成生物工程研究所）的操作說明，于520 nm處測定反應液的吸光度值，根據公式計算得到待測樣品的總抗氧化能力。

1.2.6 螺旋藻活性肽的純化 具有最高抗氧化活性的凍干粉溶解在10 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）中，經脫氣及 0.22 μm Supor膜過濾處理，然后通15/600 mm凝膠過濾柱分離。流動相為10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0，包含 150 mmol/L NaCl），流量為0.8 mL/min。洗脫峰在215 nm波長處進行檢測并收集，然后按1.2.5中所介紹方法檢測抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻蛋白質質量分數的測定結果

經Bio-Rad Protein Assay方法測定螺旋藻蛋白質含量的標準曲線如圖1所示。在稀釋不同倍數的樣品中，其中稀釋50倍的螺旋藻蛋白液在595 nm處的吸收值為0.369，基本落在標準曲線的有效線性范圍。因此，根據該樣品計算得到螺旋藻的蛋白質質量分數約為56%。

圖1 Bio-Rad Protein Assay標準曲線Fig.1 Standard curve of Bio-Rad Protein Assay

2.2 正交實驗結果

木瓜蛋白酶水解的正交試驗結果及方差分析見表2及表3。

表2 正交試驗分析Table 2 Analysis of the orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis for the orthogonal experiment

由正交試驗方差分析可知，在α=0.01水平上，A因素（溫度）的不同處理水平對指標影響顯著；B因素（酶底比）、C因素（時間）和D因素（pH）的不同處理水平對指標影響不顯著。確定各因素的主次關系為A>B>C>D，最優組合為A2B2C3D2，即溫度為60℃，酶質量分數1.6%，時間為9 h，pH為7.0。

2.3 不同相對分子質量范圍螺旋藻酶解液的抗氧化活性

螺旋藻的木瓜蛋白酶水解液經超濾得到不同分子量范圍的酶解液。如表4所示，相對分子質量范圍為0到3 000的酶解液具有最強的抗氧化活性，表明該片段活性肽捕獲自由基更容易[12-13]，因此選擇該部分酶解液進行抗氧化肽的純化。各酶解液的抗氧化肽得率按酶解前后215 nm處吸光度值的比值確定，從表2可知，相對分子質量范圍為0到3 000的酶解液的得率為（13.23±1.24）%。

表4 螺旋藻木瓜蛋白水解液的抗氧化活性Table 4 Antioxidative activities of the papain hydrolysates of Spirulina platensis

2.4 抗氧化肽的純化

相對分子質量范圍為0到3 000的螺旋藻酶解液經凝膠過濾柱分離，從圖2可以看出，在215 nm處有4個主要吸收峰（I～IV）。經1.2.5中所介紹方法檢測抗氧化活性，測得吸收峰III具有最強的抗氧化活性。

圖2 木瓜蛋白水解液的凝膠色譜圖（Sephadex G-15層析柱（1.6 cm × 60 cm））Fig.2 Gelfiltration chromatogram ofthe papain hydrolysates on a Sephadex G-15 column（1.6 cm×60 cm）

圖3 DPPH·清除標準曲線Fig.3 Clearance curve of DPPH·

圖4 OH·清除標準曲線Fig.4 Clearance curve of OH·

圖5 總抗氧化能力標準曲線Fig.5 Total antioxidative capability curve

根據抗壞血酸標準曲線，計算出清除50%DPPH自由基所需的抗壞血酸溶液用量即為半數有效量 IC50，得到 IC50（抗壞血酸）=18.36 μg/mL，而經過凝膠層析得到螺旋藻活性肽（III峰）原液（質量濃度C=0.104 2 mg/mL）的DPPH自由基清除率為（28.49±1.05）%，相當于（10.01±0.68） μg/mL 的抗壞血酸溶液。

同理可知，質量濃度為0.104 2 mg/mL螺旋藻活性肽（III峰）的清除羥基自由基清除率與（0.477±0.028）mg/mL的抗壞血酸相同，螺旋藻活性肽（III峰）原液的總抗氧化能力相當于該試劑盒條件下濃度為（0.037 9±0.008 1）mg/mL的抗壞血酸溶液。

因此，螺旋藻活性肽比相同質量的濃度的米蛋白短肽[14]的抗氧化能力強，說明是一種具有較強抗氧化活性的天然活性肽。該天然活性肽具有營養豐富、易吸收、無毒副作用等特點，因而該活性肽具有很好的應用前景。

3 結 語

木瓜蛋白酶水解的最適工藝條件為：酶質量分數1.6%、溫度60℃、水解時間9 h、pH 7.0。在最佳木瓜蛋白酶優化工藝下，水解鈍頂螺旋藻，通過超濾得到不同相對分子質量范圍的抗氧化肽混合液，其中相對分子質量范圍為0到3 000的酶解液活性最高。

經過層析得到螺旋藻活性肽（III峰）原液（C=0.104 2 mg/mL）具有較強的抗氧化活性，其DPPH·清除率、OH·清除率和總抗氧化能力分別相當于質量濃度為（1.01±0.07）×10-2mg/mL、（4.77±0.28）×10-1mg/mL 和（3.79±0.81）×10-2mg/mL 的抗壞血酸溶液。小分子肽不但具有易吸收的特點，而且經腸胃消化有良好的穩定性[15]，因此，該活性肽在保健食品和藥品中具有很好的應用前景。

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