高滲脅迫對光滑球擬酵母轉錄組的影響

徐 沙 ， 劉立明

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糖生物學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

轉錄組（Transcriptome）指一個活細胞在特定狀態下所能轉錄出來的所有mRNA的總和，包括編碼RNA和非編碼RNA[1]。研究轉錄組的一個重要方法是利用DNA芯片技術檢測有機體基因組中基因的表達。從基因組DNA轉錄的mRNA的總和即轉錄組，也稱為表達譜，是研究細胞表型和功能的一個重要手段。微生物在遭受某種刺激時，往往會伴隨著某些基因表達水平的變化。在一個有生命的生物系統中，基因組是遺傳信息的儲存體，mRNA是基因表達的中間體，功能性蛋白質是基因功能的執行體。因此，基因組和轉錄組兩者的關系不是一一對應的[2-3]。

作者前期研究發現，光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）在生產丙酮酸的過程中，隨著NaOH的不斷流加，發酵液滲透壓逐漸提高，成為丙酮酸進一步積累的關鍵限制性因素[4]。作者所在研究室通過選育一株能在含有70 g/L NaCl的培養基中正常生長的突變株，使丙酮酸產量提高了41.1%[5]。目前，國內外針對酵母應對滲透壓脅迫的機制已有一些研究。Rep等在研究高滲脅迫對釀酒酵母轉錄水平的影響時發現，多數上調基因的功能是編碼滲透保護蛋白質或者是甘油、海藻糖和糖原代謝途徑中的酶[6]。隨后，Yale等研究NaCl脅迫不同時間后（10、30 min和90 min）釀酒酵母轉錄水平的變化。結果表明，隨著脅迫時間的延長，上調基因的數量逐漸增加，且與能量相關的基因表達隨著脅迫時間的延長而升高，在30 min時出現峰值[7]。國內Han Yanping等對鼠疫耶爾森氏桿菌（Yersinia pestis）在高滲和高鹽脅迫下的差異表達基因進行分析，結果發現那些合成滲透保護劑轉運蛋白質和一系列致病因子的基因以及一些全局性轉錄因子都發生了上調[8]。

雖然已有文獻報道了高滲脅迫對酵母轉錄組的影響，但在T.glabrata中尚未見文獻報道。T.glabrata發酵過程的主要產物丙酮酸，是糖酵解途徑的最終產物，在后續的代謝中，將進入線粒體氧化生成乙酰CoA，進入三羧酸循環，最終被氧化成CO2和水。其代謝過程中產生的NADH會進入氧化磷酸化途徑，為細胞提供大量ATP。因此中心代謝途徑和能量代謝途徑對丙酮酸生產來說非常重要。此外，已有研究表明，氨基酸是重要的微生物相容性溶質，可以保護細胞抵御滲透壓脅迫的影響[9]。基于上述分析，本文著重討論了糖酵解途徑、三羧酸循環、氧化磷酸化和氨基酸代謝途徑中關鍵酶轉錄水平的變化，以期能夠從整體水平揭示特定生物學過程以及脅迫過程的分子機理，研究不同滲透壓條件下基因轉錄水平的變化，為后續研究如何提高T.glabrata抵御高滲脅迫的能力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

T.glabrata CCTCC M202019，為煙酸（NA）、硫胺素（B1）、吡哆醇（B6）和生物素（Bio）的營養缺陷型，由作者所在研究室自行篩選并保藏[9]。

1.2 培養基

1.2.1 斜面和種子培養基 葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L， KH2PO41 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L， 瓊脂20 g/L（斜面培養基用）。

1.2.2 發酵培養基 葡萄糖100 g/L，NH4Cl 7 g/L，KH2PO45 g/L， MgSO4·7H2O 0.8 g/L， 乙酸鈉 6 g/L，煙酸4 mg/L，鹽酸硫胺素30 μg/L，煙酸吡哆醇100 μg/L，生物素 10 μg/L，核黃素 50 μg/L， CaCO340 g/L（僅限搖瓶培養時調節pH用）。添加NaCl改變發酵培養基滲透壓，0、30、50、80 g/L NaCl對應的溶液滲透壓分別為860，1 765，2 603 mOs mol/kg和3 324 mOs mol/kg。培養基初始pH 5.5。維生素液過濾除菌后加入。

1.2.3 搖瓶培養 從新鮮斜面上接一環菌入種子培養基 （50 mL置于500 mL的錐形瓶），于30℃、200 r/min下搖瓶培養24 h后，以體積分數10%接種量接入發酵培養基。搖瓶發酵：500 mL的錐形瓶中發酵培養基為50 mL，溫度30℃，轉速200 r/min，發酵時間為48 h。

1.3 滲透壓測定

發酵液滲透壓采用OSMOMAT 030冰點滲透壓儀測定。

1.4 RNA的提取與表達譜芯片分析

1.4.1 總RNA抽提（Trizol法）

1）取對數生長中期的細胞，每2×107個細胞加入1 mL Trizol，在震蕩混勻后，液氮研磨充分破碎細胞。

2）按體積比1∶5加入氯仿，充分混勻后室溫靜置5 min。

3）4℃，12 000 r/min離心15 min，取出上清液并轉入新1.5 mL的離心管中，加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置5 min。

4）4℃、12 000 r/min離心10 min，去上清液后，按體積比2∶5向沉淀中加入體積分數70%的乙醇，4℃、12 000 r/min離心洗滌沉淀15 min。

5）沉淀室溫晾干后，加入適量無RNA酶水充分溶解，測定OD260和OD280值。

6）按操作說明采用無RNA酶的DNA酶I（Takara）處理。

1.4.2 基因芯片合成 表達譜芯片由上海康成生物工程有限公司委托Agilent依據Torulopsis glabrata CBS 138基因組全序列設計合成。基于Sanger的測序結果表明，T.glabrata CCTCC M202019的18s rRNA與該菌株100%一致。

1.4.3 芯片雜交與洗滌 委托上海康成生物工程有限公司完成。

1.4.4 芯片掃描與數據分析

1）通過 Agilent Scanner獲取圖像并在 10 μm條件下掃描像素值；

2）圖像使用Feature Extraction進行定量分析，得到圖像定量和標準化處理數據。

2 結果與分析

2.1 轉錄組概況

T.glabrata細胞在不同的滲透壓條件下（860、1 765、2 603 mOs mol/kg 和 3 324 mOs mol/kg）培養到對數生長中期，收集細胞，采用全基因組芯片檢測進行全基因組基因表達水平分析。根據NCBI數據 庫 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 的 T.glabrata CBS138基因信息，在芯片上設計了5 280個寡核苷酸探針，其中有5 009個基因的表達被檢測出來。利用GenBank、KEGG、UniProt等公共數據庫對未知基因進行高精度注釋，結果有3 500個以上的基因可以通過基因注釋初步確定其功能。

一般認為基因表達水平發生2倍及以上變化的基因發生了差異表達。在滲透壓為1 765、2 603 mOs mol/kg和3 324 mOs mol/kg的條件下，相對于對照條件（860 mOs mol/kg），分別有 1 335、1 155 和1 630個基因轉錄水平上調，818、789和770個基因轉錄水平下調。

2.2 GO功能富集

對上述差異基因進行GO功能富集分析，結果見圖 1。高滲脅迫條件（1 765、3 324 mOs mol/kg）與正常條件（860 mOsmol/kg）相比，發生轉錄水平上調變化的基因主要集中于以下功能類群（圖1（a））：結合 （binding）、DNA 結 合 （DNA binding）、 核 酸 結 合（nucleic acid binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、鎂離子結合（magnesium ion binding）、激酶活性（kinase activity）、催化活性（catalytic activity）、核苷酸結合（nucleotide binding）、水解酶（hydrolase activity）、 蛋白質結合 （protein binding）、 肽活性（peptidase activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、ATP 結合 （ATP binding）、GTP 結合（GTP binding）、鋅離子結合（zinc ion binding）、金屬離子結 合 （metal ion binding）、 轉運活性 （transporter activity）、轉移酶活性（transferase activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）。

這些功能類群主要參與蛋白質翻譯及修飾、能量代謝、核酸復制和物質轉運等過程。轉錄發生下調的基因主要功能類群（圖1（b）），除與上調基因相同的部分之外，還包括序列特異的DNA結合轉錄因 子 的 活 性 （sequence-specific DNA binding transcription factor activity）、解旋酶的活性（helicase activity）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）和RNA結合（RNA binding）等。

進一步分析在較低高滲條件 （1 765 mOs mol/kg）和極端高滲條件下（3 324 mOs mol/kg）轉錄水平提高10倍以上的基因。其中已知功能的分別有90和96個（圖2，只選取提高倍數前50的基因作圖）。其中細胞壁甘露糖蛋白質（CAGL0I06204g）、脂肪酸延伸蛋白質（CAGL0L08184g）的轉錄水平在較低的高滲條件下提高了60倍以上；另外，產孢調節蛋白質（CAGL0E04840g）、磷脂酶（CAGL0J11748g）、信息素調節膜蛋白質 4（CAGL0M02167g）和 10（CAGL0G04433g）等的轉錄水平也都有不同程度的大幅提高。在極端高滲條件下（3324 mOs mol/kg），信息素調節膜蛋白質10甚至提高了88.6倍，而脂肪酸延伸蛋白質和細胞壁甘露糖蛋白質的上調水平相比較低的高滲條件略有下降，分別提高了54.9倍和34.8倍。除此之外，液泡堿性氨基酸轉運蛋白質（CAGL0J01375g）的轉錄在極端高滲條件下（3 324 mOs mol/kg）增加了11.70倍，高于滲透壓較低情況下（1 765 mOs mol/kg）的2.70倍。

圖1 高滲培養條件下差異表達基因的GO功能富集分析Fig.1 GO functional enrichment analysis of differentially expressed genes

圖2 在高滲條件下表達水平上調10倍以上的基因Fig.2 Genes upregulated more than 10 times by hyperosmotic stress

在兩種高滲條件下 （各為1 765 mOs mol/kg和3 324 mOs mol/kg）轉錄水平都提高10倍以上的基因共58個。這表明在這兩種情況下，T.glabrata細胞調控表達的機制可能有所不同。但是仍然可以發現，這些表達量大幅度提高的基因主要是細胞壁、細胞膜相關的和一些膜上的信息素蛋白質基因。因為細胞外環境的改變直接作用于微生物的細胞壁和細胞膜，胞外滲透壓提高，胞內水分外流，隨后胞內溶液濃度升高，從而導致細胞體積減小，肽聚糖層被破壞，并最終質壁分離。細胞壁和細胞膜最先感應到外界環境的改變，其受影響的程度可能是最為劇烈的。

2.3 糖酵解途徑中的基因表達譜

糖酵解是將葡萄糖降解為丙酮酸并伴隨著ATP生成的一系列反應。如表1所示，在高滲環境下，EMP途徑中有7個基因的轉錄水平發生了上調，這7個基因分別涉及到6種酶，即己糖激酶（CAGL0H07579g）、 6- 磷 酸 葡 萄 糖 變 構 酶（CAGL0K03289g）、 6- 磷 酸 葡 萄 糖 異 構 酶（CAGL0H05445g）、 6- 磷 酸 果 糖 激 酶（CAGL0F08041g和 CAGL0L10758g）、 3-磷酸甘油酸脫氫酶 （CAGL0J00451g）和丙酮酸激酶（CAGL0E05610g）。另外，在高滲條件下，有1個基因轉錄水平略微下調，即1，6-二磷酸果糖酶（CAGL0H04939g）。 但是，1，6-二磷酸果糖酶催化1，6-二磷酸果糖為6-磷酸果糖，是EMP途徑的逆反應，其轉錄水平的下調對EMP途徑的代謝有促進作用。

EMP途徑中有3個酶參與不可逆反應，分別是磷酸果糖激酶，己糖激酶和丙酮酸激酶，這3種酶調節著糖酵解的速度。研究結果發現，非極端高滲環境對己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的基因轉錄有一定的誘導作用，但在極端高滲條件下誘導作用不明顯。總體而言，相比正常條件高滲環境下的酵母細胞EMP途徑略有上調，但幅度不大，而且多數基因的表達水平只在滲透壓相對較低的條件下（1 765 mOs mol/kg）有所提高，極端高滲條件下沒有基因發生明顯上調，說明EMP途徑的轉錄水平和滲透壓的影響關系不大。

2.4 三羧酸途徑中的基因表達譜

三羧酸循環（Tricarboxylic acid cycle，TCA）在動植物、微生物細胞中普遍存在，不僅是糖代謝的核心途徑，也是脂肪、蛋白質分解代謝的最終途徑。如表2所示，T.glabrata在高滲條件下，TCA循環途徑相關基因轉錄水平整體上調。α-酮戊二酸脫氫酶E1組 分 （CAGL0G08712g）、 檸 檬 酸 合 酶（CAGL0B03663g和CAGL0L09086g）、 異檸檬酸脫氫酶（CAGL0I07227g 和 CAGL0B04917g）、蘋果酸脫氫酶（CAGL0L05236g）、丙酮酸脫氫酶E1組分β亞基 （CAGL0K06831g）和丙酮酸脫氫酶 E2組分（CAGL0J10186g）等TCA循環中的關鍵酶基因，均在高滲條件下表達被誘導。只有延胡索酸酶（CAGL0A01045g）、丙酮酸羧化酶（CAGL0F06941g）和琥珀酸脫氫酶（CAGL0C03223g）在極端高滲條件下基因表達水平受到抑制。

表1 糖酵解途徑中的差異表達基因Table 1 Differential expression genes in EMP pathway

表2 三羧酸循環途徑中的差異表達基因Table 2 Differential expression genes of TCA cycle

TCA循環的多個反應都是可逆的，但是檸檬酸的合成及α-酮戊二酸的氧化脫羧二步反應是不可逆的。因此三羧酸循環的調節部位有3個，即檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶催化的反應。這3個酶催化反應都伴隨著ATP的形成或NADH的產生 （進入氧化磷酸化途徑最終形成ATP）。在高滲條件下，這3個酶有部分基因的轉錄發生了上調。可能的原因是：環境滲透壓過高，導致胞內Na+含量增加，并且對細胞具有毒害作用，觸發Na+/H+反向輸送，逐出Na+，引入質子，需要消耗一定的能量。另外，細胞需要合成一些特定的相容性溶質來抵御滲透壓脅迫，這些物質的合成也需要消耗能量。因此，細胞需要加快產能途徑的代謝來滿足微生物抵御脅迫的需要。

2.5 磷酸戊糖途徑的基因表達譜

磷酸戊糖途徑的主要作用是：產生NADPH（NADPH不參與呼吸鏈，不產生ATP），為細胞的各種合成反應提供還原力；生成磷酸核糖，為核酸代謝做物質準備；分解戊糖，其中間產物為許多化合物的合成提供原料。

如表3所示，磷酸戊糖途徑在高滲條件下有13個基因8種酶轉錄水平上調，分別是：

葡萄糖激酶（CAGL0K11297g），葡萄糖-6磷酸異構酶 （CAGL0H05445g），磷酸葡糖酸內酯酶（CAGL0I02200g），核酮糖磷酸-3-異 構 酶（CAGL0L05478g），6-磷酸果糖激酶（CAGL0F08041g和 CAGL0L10758g）， 5-磷酸核糖異構酶 （CAGL0L03740g），核糖激酶（CAGL0L08228g），磷酸核糖焦磷酸激酶（CAGL0C05181g、CAGL0D00550g、CAGL0I05500g、CAGL0K02541g）和葡萄糖磷酸變位酶（CAGL0M02981g）。其中核糖激酶上調幅度較大。

另外，有5個基因4個酶發生下調，分別是：6-磷酸葡萄糖脫氫酶 （CAGL0J07612g），1，6-二磷酸果糖酶（CAGL0H04939g），轉醛醇酶（CAGL0B03069g、CAGL0K04235g）和葡萄糖磷酸變位酶（CAGL0K07480g）。

表3 磷酸戊糖途徑差異表達基因Table 3 Differential expression genes in pentose phosphate pathway

在磷酸戊糖途徑的氧化脫羧階段，6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性最低，是整個途徑的限速酶。該酶的基因表達在高滲條件下沒有明顯變化，在極端高滲條件下轉錄水平甚至受到了抑制。而其他一些基因轉錄水平的提高，可能與合成特定相容性溶質需要某些中間產物有關。

2.6 氧化磷酸化途徑的基因表達譜

氧化磷酸化途徑是將營養物質最終氧化分解，生成CO2和水并釋放出能量的過程，稱為生物氧化，是好氧條件下細胞能量的主要來源。如表4所示，氧化磷酸化途徑轉錄水平整體呈現上調，有26個基因在高滲條件下轉錄水平提高。其中，H+轉運ATP酶的轉錄水平增加10倍以上，變化極為顯著。此外，值得注意的是，多數差異表達的蛋白質，較低滲透壓條件（1 765 mOs mol/kg）相比極端高滲條件（3 324 mOs mol/kg）轉錄上調幅度更大；而轉錄水平下調的8個基因NADH脫氫酶（NADH dehydrogenase）、 琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白質（succinate dehydrogenase iron-sulfur protein）、琥珀酸脫氫酶黃素蛋白質亞基 （succinate dehydrogenase flavoprotein subunit）、輔酶Q-細胞色素 C還原酶細 胞 色 素 C1 （ubiquinol-cytochrome c reductase cytochrome c1 subunit）、 V-型 H+-ATP 酶亞基 I（V-type H+-transporting ATPase subunit I）、 F-型 H+-ATP 酶亞基 Δ （F-type H+-ATPase subunit delta）、F-型H+-ATP酶寡霉素敏感相關蛋白質 （F-type H+-ATPase oligomycin sensitivity conferral protein）和F-型H+-ATP酶亞基h（F-type H+-ATPase subunit h），在極端高滲條件下，轉錄水平下降幅度更大。可能的原因是，極端高滲條件使某些RNA轉錄酶的活性受到抑制，從而影響了部分基因的轉錄。總之，上述結果表明，高滲脅迫總體上促進了氧化磷酸化途徑基因轉錄水平的提高，但部分基因在極端高滲條件下，轉錄水平反而呈現下降。

表4 氧化磷酸化途徑的差異表達基因Table 4 Differential expression genes of oxidative phosphorylation

2.7 信號轉導途徑基因表達譜

HOG-MAPK途徑（圖3）是絕大多數酵母抵御高滲脅迫的主要信號轉導機制。

轉錄組分析結果表明，HOG-MAPK途徑中的關鍵基因Sho1p、Ste20p、Ste11p和Hog1p轉錄水平略有上調，但幅度不是很大；Sln1p、Ssk1p、Pbs2p和Glo1p轉錄水平有所下調，其中Pbs2p在極端高滲條件下（3 324 mOs mol/kg）受到比較明顯的抑制，轉錄水平下降至正常條件下（860 mOs mol/kg）的12.6%。

總體來說，相對于釀酒酵母和其他大部分酵母而言，高滲脅迫對T.glabrata的HOG-MAPK信號轉導途徑影響不大，即高滲沒有明顯誘導T.glabrata信號轉導途徑的基因轉錄。這與研究室前期在研究T.glabrata發酵過程較少檢測到甘油生成的結果是一致的。這也表明，T.glabrata可能存在其他應對高滲脅迫的機制。

圖3 HOG-MAPK信號通路Fig.3 HOG-MAPK signaling pathway.Dark gray：upregulated；Light gray：downregulated

2.8 氨基酸合成與代謝途徑的基因表達譜

作者分析了谷氨酸、脯氨酸和精氨酸的合成與分解代謝途徑中相關基因的表達。除精氨酸外，谷氨酸和脯氨酸都被證實可以在特定的微生物中積累，作為相容性溶質，抵御環境脅迫的影響。分析結果如表5所示。處于精氨酸分解途徑中尿素羧化酶（CAGL0M05533g）轉錄水平明顯下調，下降了99%以上，表明在高滲脅迫的條件下精氨酸分解能力下降。由于精氨酸的代謝與含氮有機化合物的代謝有關，在后續的研究中可以考慮表達精氨酸合成途徑中的關鍵酶，而不是敲除精氨酸分解途徑中的酶來提高精氨酸在胞內的積累。

表5 氨基酸合成與代謝途徑的基因表達Table 5 Changes in genes expression of amino acids metabolic pathway

另外，脯氨酸和谷氨酸合成途徑中的酶轉錄水平都有一定程度的提高，但是幅度不大。因此在后續的實驗中可以考慮過量表達這些合成酶，或者通過在胞外補加脯氨酸或谷氨酸來促進胞內這兩種氨基酸的積累，達到提高細胞抗脅迫能力的目的。

3 討論

中心代謝途徑是最重要的葡萄糖代謝途徑，也是重要的產能途徑，有部分酶的基因在高滲條件下差異表達。在糖酵解途徑中，6-磷酸葡萄糖變構酶（CAGL0K03289g）在滲透壓為 2 603 mOs mol/kg 的條件下，轉錄水平發生上調。該酶催化α-6-磷酸葡萄糖到β-6-磷酸葡萄糖的反應，可能會在一定程度上影響糖酵解途徑的碳通量。總體而言，發酵液滲透壓的提高誘導糖酵解途徑的轉錄發生上調，特別是丙酮酸激酶（CAGL0E05610g）在滲透壓為1 765 mOs mol/kg和2 603 mOs mol/kg兩個條件下，轉錄水平分別上調2.91倍和2.61倍。已有研究表明，與能量相關的基因表達會隨著高滲脅迫時間的延長而提高，特別是呼吸和能量代謝相關的基因。在釀酒酵母中，鹽脅迫30 min后，被誘導表達的ORFs（open reading frames，開放閱讀框）中有 9.1%是電子傳遞鏈的組分，例如細胞色素和ATP合成酶復合體等[7]。本研究中發現，在高滲條件下與能量相關代謝途徑（如三羧酸循環、氧化磷酸化途徑等）的基因多數表達水平提高，尤其是那些參與產生ATP或形成NADH的基因。在有氧條件下，胞內NADH通過氧化磷酸化途徑合成ATP。在氧化磷酸化過程中有5個酶復合體，其成分非常復雜。總體而言，復合體III、IV、V的轉錄水平都有明顯上調，而復合體I和II可能略有下調。氨基酸是一類重要的相容性溶質，糖酵解途徑和三羧酸循環為其合成提供重要的前體物質。谷氨酸合成酶（CAGL0L01089g）催化α-酮戊二酸合成谷氨酸，但研究發現該酶的轉錄水平并沒有發生明顯上調。而催化谷氨酸代謝形成脯氨酸或精氨酸的吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（CAGL0D03982g）和N-乙酰谷氨酸轉移酶（CAGL0F06501g）轉錄水平都發生了明顯的上調。該結果說明T.glabrata可能與某些植物細胞類似，具有積累精氨酸或脯氨酸抵御滲透壓脅迫的生理機制。

4 結語

綜上所述，中心代謝途徑、能量代謝途徑和氨基酸代謝途徑對T.glabrata抵御滲透壓脅迫具有重要影響。作者在后面的研究中將對上述3個途徑進行調控和改造，如通過增強T.glabrata產生ATP，在T.glabrata胞內過量積累精氨酸、脯氨酸等手段，達到提高T.glabrata抵御滲透壓脅迫能力的目的。

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