黃曲霉毒素B1與雜色曲霉素對HepG2細胞的聯合毒性

劉 洋， 杜 明， 張根義

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

復雜的自然界中經常會有不同類型的真菌毒素共同存在，人們在生活中有可能同時接觸2種甚至2種以上的毒素，不同毒素共存時對機體的聯合毒性作用引起了人們的廣泛研究。M.J.Ruiz研究了白僵菌素（BEA）、嘔吐毒素（DON）和 T-2毒素在CHO-K1細胞中的聯合作用，其中BEA和T-2毒素為協同作用，DON與BEA、T-2均顯示為拮抗作用[1]；熊麗林求得微囊藻毒素和黃曲霉毒素及伏馬菌素的聯合作用類型為加和作用[2]。

黃曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1，簡稱 AFB1）是目前已知的毒性較強的真菌毒素，它可以導致誘發性肝癌的產生。有關黃曲霉毒素在不同劑量下單獨作用于多種細胞的急慢性毒性已有很多報道，但關于黃曲霉毒素與其它毒素的聯合作用的毒性研究較少。雜色曲霉素（Sterigmatocystin，簡稱ST）由10多種真菌代謝產生，是一種含有呋喃環的氧雜蒽酮類化合物，已知被ST污染的食品包括大米、小麥、玉米、花生、大豆、火腿、奶酪、咖啡等，而黃曲霉毒素AFB1也廣泛存在于各種谷物和飼料中，它們共存的可能性非常高。為此選取了黃曲霉毒素B1和雜色曲霉素進行聯合毒性的研究。AFB1的主要靶器官是肝臟，同時ST在肝內會轉化成1，2-環氧ST，該物質會與DNA形成加合物，這極有可能是ST導致肝癌發生的機制[3]，因此肝臟是 AFB1和 ST共同的主要靶器官。

HepG2細胞來源于人肝胚細胞瘤，分化程度較高[4]，并且其所含的生物轉化代謝酶與人正常肝實質細胞具有同源性，其中肝細胞色素P450是主要參與體內藥物代謝的酶系[5]，對許多內源性、外源性化合物在體內Ⅰ相生物轉化有重要作用，許多藥物通過P450酶的調控作用來影響其活性，因而選擇HepG2細胞為實驗對象，來研究AFB1和ST的聯合毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2人肝癌細胞，中國科學院細胞庫提供；DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰酶、無酚紅HBSS，Gibco公司提供；雜色曲霉素標準品（ST）、黃曲霉B1標 準 品 （AFB1）、SRB、TCA、H33258、Tris base、小 牛胸腺 DNA、DCFH-DA、DCF、羅丹明 123，Sigma公司提供；ATP檢測試劑盒，碧云天生物技術公司提供；Infinite 1000酶標儀，Tecan公司產品。

1.2 細胞培養與染毒

HepG2細胞用內含體積分數10%胎牛血清、質量分數0.5%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基，于37℃、質量分數5%CO2培養箱中培育至對數生長期[6]。用DMSO溶解AFB1、ST制成母液，再用DMEM培養基稀釋1 000倍至DMSO終質量分數為0.1%的儲備液。用含有質量分數0.1%DMSO溶液的DMEM培養基將儲備液配制為所需濃度的工作液。

1.3 細胞毒性測定方法

1.3.1 SRB法測定AFB1、ST對HepG2細胞的半數抑制濃度 調整對數期細胞密度為3×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養液，加入含AFB1或者ST的培養液繼續培養48 h。每孔加入4℃預冷的三氯乙酸（TCA）溶液，4℃固定1 h，去離子水洗4～5次，風干后每孔加入4 g/L SRB溶液，室溫下孵育30 min，用質量分數1%乙酸洗4～5次，風干后每孔加入10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），搖動混勻，震蕩5 min后在490 nm下測定吸光度A（下標g、k、d分別表示給藥組、空白組、對照組）。計算不同時間、不同濃度的真菌毒素對HepG2細胞的增殖抑制率。增殖抑制率

Y=[1-（Ag-Ak）/（Ad-Ak）]×100%。

其中 AFB1染毒濃度為 0 （溶劑對照）、1、5、10、50、100 μmol/L，ST 染毒濃度為 0（溶劑對照）、0.1、1、5、10、14 μmol/L，溶劑對照組為含有質量分數0.1%DMSO的DMEM培養基，每個實驗組4個重復。

1.3.2 AFB1和ST對HepG2細胞各部位損傷的檢測 設置染毒劑量時使大部分細胞處于染毒未致死的狀態，其中AFB1染毒濃度為0（溶劑對照）、0.5、1、5、10 μmol/L；ST 染毒濃度為 0 （溶劑對照）、0.5、2.5、5、7 μmol/L；聯合染毒組設置為 0（溶劑對照），AFB1（10 μmol/L）+ST（濃度設置與單獨染毒組相同），ST（5 μmol/L）+AFB1（濃度設置與單獨染毒組相同）；對照組為含有質量分數0.1%DMSO的DMEM培養基，每個實驗組4個重復[2]。

1）SRB法測定細胞增殖力的變化：操作步驟同1.3.1。

2）細胞內總DNA含量的測定：調整對數期細胞密度為 5×104個/mL，每孔 200 μL接種于 96孔板中孵育24 h后，棄去培養液，加入含AFB1或者ST的培養液繼續培養24、48 h。染毒24 h或48 h后，棄培養基，37℃預熱的HBSS洗一遍，將96孔板置于-80℃的冰箱中冷凍1 h，然后置于37℃水浴鍋中加熱30 min，在所有樣品孔、對照孔和空白孔中加入100 μL去離子水，再放入-80℃冰箱中冷凍1 h，37 ℃加熱 30 min后，每孔加入 100 μL 5 mg/mL的H33258染料，同時繪制小牛胸腺DNA標準曲線。室溫下避光靜置30 min后用熒光酶標儀測各孔的熒光值[7]。

3）細胞內ATP含量的測定：調整對數期細胞密度為5×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養液，加入含AFB1或者ST的培養液繼續培養24、48 h。染毒24 h或48 h后，棄培養基，每孔加入20 μL ATP裂解液（冰上操作），反復吹打使細胞完全裂解，每孔加180 μL PBS將裂解液洗出，12 000 g離心10 min后，取100 μL上清液，加入預先加有100 μL ATP檢測工作液的底部透明板中，迅速混勻后，立即用化學發光酶標儀檢測熒光值。根據標準曲線計算出加藥組細胞內ATP濃度。

4）細胞內線粒體通透性的轉換：調整對數期細胞密度為 5×104個/mL，每孔 200 μL接種于 96孔板中孵育24 h，棄培養基，每孔加入5 μg/mL羅丹明123工作液，質量分數5%CO237℃孵育30 min后，1 000 r/min離心10 min，用培養基洗一遍，相同條件離心后加入含AFB1或者ST的培養液繼續培養24、48 h，使用熒光酶標儀測定熒光值，根據標準曲線計算出加藥組細胞內檢測到的羅丹明123含量，判斷細胞內線粒體通透性的改變。

5）細胞內活性氧含量的測定：調整對數期細胞密度為5×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養液，37℃預熱的PBS洗一遍后，加入37℃預熱的DCFH-DA探針（終濃度為10 μmol/L，溶解于DMEM中），37℃避光孵育30 min后，1 000 r/min離心10 min，將探針吸除，加入DMEM清洗探針，再1 000 r/min離心10 min，吸除DMEM后將各孔換為含AFB1或者ST的培養液繼續培養24、48 h，采用熒光酶標儀檢測二氯熒光黃（DCF）的熒光強度[8]。

1.4 統計分析

實驗數據均以x±s進行表示，使用SPSS20.0軟件進行統計分析，采用origin18.1軟件繪圖。用Probit analysis算出各毒素的IC50[9]。ST與AFB1混合物對HepG2聯合毒性作用類型采用成對樣本T檢驗“預測值”和“測量值”之間的顯著性差異，若P＞0.05，表示兩組數據無顯著性差異，反映AFB1與ST的聯合毒性為加和作用[10]。其中，“預測值”為AFB1或ST的固定濃度產生的效應值與另一種毒素的各濃度梯度單獨作用于細胞分別產生的效應值的相加值；“測量值”為兩種毒素以不同濃度混合后實際測得毒素對細胞產生的效應值。5個毒性作用終點采用主成分分析法（PCA）進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 AFB1、ST對HepG2細胞的半數抑制濃度

AFB1和ST對HepG2細胞增殖力的抑制率呈現劑量相關性，根據實驗中染毒濃度對應的細胞增殖力抑制率，使用SPSS進行Probit analysis分析，概率為50%時對應的濃度即為該毒素對HepG2細胞的半數抑制濃度（IC50）。兩種毒素對HepG2細胞的IC50如表1所示。從表1可看出，ST的 IC50要比AFB1的IC50低50%，說明ST對HepG2細胞的毒性高于AFB1的毒性。

2.2 AFB1、ST單獨作用及聯合作用對HepG2細胞的細胞增殖力影響

AFB1、ST對細胞的毒性作用在24 h時并沒有明顯的趨勢，48 h時細胞增殖力的降低程度基本呈現毒素劑量相關性。如圖1所示，細胞染毒48 h后，與對照組（100%）相比，單獨作用時AFB1濃度在0.5～10 μmol/L時，細胞增殖力抑制率為 6.28%～43.59%， 呈指數型下降；ST濃度在 0.5～7 μmol/L時，細胞增殖力抑制率為24.32%～49.5%，呈線性下降；聯合作用時，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組中，ST濃度為0.5 μmol/L時的抑制率為45.39%，同單獨作用時ST的最大濃度即7 μmol/L的抑制率基本一致。并且從圖1（b）可以看出，AFB1+ST混合組的抑制率均高于單獨作用組，其中 ST（5 μmol/L）+AFB1混合組的細胞增殖力呈指數型下降，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組的增殖力呈線性下降，可以看出兩種毒素混合后并不會影響毒素自身對細胞增殖力抑制作用的變化規律。

表 1 AFB1、ST 對 HepG2的 IC50Table 1 IC50determinations of AFB1and ST in HepG2 by probit analysis

圖1 AFB1和ST對HepG2細胞的細胞增殖力的影響（48 h）Fig.1 Inhibition rate of AFB1and ST in HepG2（48 h）

2.3 AFB1、ST單獨作用及聯合作用對HepG2細胞DNA含量的影響

細胞在96孔板中經過兩次凍融循環被破壞并釋放DNA，而H33258與雙鏈DNA結合時由非熒光物質轉化為高熒光物質，反映了細胞中總DNA的含量。AFB1、ST對細胞DNA含量的影響在24 h時并不明顯，48 h時DNA含量的降低程度基本呈現毒素劑量相關性。如圖2所示，細胞染毒48 h后，與對照組 （100%）相比，單獨作用時AFB1濃度在0.5～10 μmol/L 時，DNA 質量分數（相對質量）下降為110.55%～55.21%，呈對數型下降；ST濃度在0.5～7 μmol/L時，DNA質量分數下降為 116.27%～76.89%，下降趨勢可用乘冪回歸表示；實驗結果中細胞DNA含量在低劑量組中出現了高于對照組DNA含量的現象，可能由于低劑量的毒素未對細胞造成損傷，反而引起細胞內的抵抗反應，合成了較多的DNA，從而高出對照組的含量。聯合作用時，ST（5 μmol/L）+AFB1混合組中，AFB1濃度為 0.5 μmol/L時的DNA質量分數下降為54.72%，同單獨作用時AFB1的最大濃度即10 μmol/L時的DNA含量基本一致。

圖2 AFB1和ST對HepG2細胞內DNA含量的影響（48 h）Fig.2 Effect of AFB1and ST on DNA content in HepG2 cells（48 h）

從圖2（b）可以看出，AFB1+ST混合組的DNA減少量均高于單獨組，其中 ST（5 μmol/L）+AFB1混合組的細胞增殖力呈對數型下降，ST+AFB1（10 μmol/L）混合組的增殖力的下降趨勢可用乘冪回歸表示，可以看出毒素在單獨作用和聯合作用時，并不會因為另外一種毒素的混合而影響其本身對細胞的毒性作用。

2.4 AFB1、ST單獨作用及聯合作用對HepG2細胞ATP水平的影響

細胞ATP水平在24 h時已基本呈現毒素劑量相關性，48 h時ATP含量的降低程度更加明顯。如圖3所示，細胞染毒24 h后，與對照組（100%）相比，AFB1濃度在 0.5～10 μmol/L 時，單獨作用及聯合作用時ATP含量呈線性下降；而ST單獨作用濃度在 0.5～7 μmol/L時，ATP摩爾分數（相對物質的量）下降為42.30%～22.21%，為乘冪型下降，與AFB1聯合作用后同樣呈乘冪型下降。ATP是5個毒性作用終點中最早對毒素產生顯著反應的指標，較早的反應細胞的染毒狀態可以作為細胞染毒的早期檢測指標。

圖3 AFB1和ST對HepG2細胞內ATP含量的影響（24 h）Fig.3 Effect of AFB1and ST on ATP content in HepG2 cells（24 h）

2.5 AFB1、ST單獨作用及聯合作用對HepG2細胞線粒體通透性的影響

羅丹明123在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質，熒光強度減弱或消失。而在凋亡發生時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉運孔開放，引起線粒體跨膜電位（ΔΨm）的崩潰，羅丹明123重新釋放出線粒體，發出強黃綠色熒光。通過熒光信號的強弱，檢測線粒體膜電位的變化和凋亡的發生。如圖4所示，細胞染毒48 h后，隨著AFB1和ST濃度的增加，細胞內羅丹明123的含量有上升的趨勢，但上升的程度并不明顯，但從圖4（b）可看出，AFB1和ST混合組中羅丹明123的含量增長率均明顯高于單獨作用組。

圖4 AFB1和ST對HepG2細胞內線粒體膜通透性的影響（48 h）Fig.4 Effect of AFB1and ST on mitochondrial membrane permeability in HepG2 cells（48 h）

2.6 AFB1、ST單獨作用及聯合作用對HepG2細胞活性氧水平的影響

細胞中二氯熒光黃（DCF）的熒光強度反映細胞中活性氧的含量。染毒24 h后細胞中活性氧的產生并不明顯，48 h時細胞活性氧含量的增加基本呈現毒素劑量相關性，如圖5所示。

圖5 AFB1和ST對HepG2細胞內活性氧含量的影響（48 h）Fig.5 Effect of AFB1and ST on reactive oxygen in HepG2 cells（48 h）

細胞染毒48 h后，與對照組（100%）相比，單獨作用時AFB1濃度在0.5～10 μmol/L時，活性氧摩爾分數（相對物質的量）上升為99.50%～115.29%；ST濃度在0.5～7 μmol/L時，活性氧摩爾分數上升為106.28%～116.27%； 聯合作用時，ST （5 μmol/L）+AFB1混合組中，AFB1濃度為1 μmol/L時的ROS的摩爾分數值為102%，同單獨作用時AFB1濃度為5 μmol/L的ROS含量基本一致。通過擬合，AFB1和ST在單獨作用和聯合作用時均呈指數型下降，并且從圖5（b）可以看出，AFB1+ST混合組的活性氧增加量均大于單獨作用組，可以得出兩種毒素混合后對HepG2細胞的毒性作用有所增強。

2.7 AFB1與ST混合物對HepG2細胞的聯合毒性作用

5個毒性作用終點的測量值與預測值的顯著性分析如表2所示，細胞增殖力、ATP含量、DNA含量、ROS含量及線粒體膜電位的測量值與預測值之間均無顯著性差異，表明AFB1和ST對HepG2的聯合毒性表現為加和作用。

表2 成對樣本T檢驗分析混合物的測量值及預測值差異性Table 2 Principal component analysis of five endpoints

2.8 AFB1和ST對HepG2細胞的5個作用終點的主成分分析

AFB1及ST對HepG2細胞48 h毒性作用的PCA分析如表3所示。

根據各個作用終點在2個成分中的系數，AFB1和ST對HepG2細胞的單獨作用及聯合作用終點均可分為3類：細胞增殖力；ATP含量、DNA含量；活性氧含量（ROS）和線粒體膜通透性（MMP）。根據主成分分析分類結果，ROS的產生與線粒體膜通透性的下降反映了兩種毒素對細胞的同一損傷效應。因線粒體受損后產生活性氧，進一步對線粒體氧化損傷，故深入研究時，可根據分類結果選取每類中的一個指標進行毒素對細胞的毒性作用檢測。

表3 AFB1及ST對HepG2毒性5個作用終點的主成分分析Table 3 Principal component analysis of five endpoints

3 討論

首次得出雜色曲霉素ST在HepG2細胞中的IC50值；并且以HepG2細胞為對象，以5個毒性作用終點為依據，研究了AFB1和ST兩種真菌毒素的聯合作用類型，經分析推斷其聯合毒性作用類型為加和作用。本實驗中5個毒性終點從不同方面檢驗了AFB1和ST對HepG2細胞的毒性。有研究發現，細胞受到毒素刺激后，細胞內線粒體膜電位的下降會伴隨著ATP水平的下降，同時線粒體是活性氧產生的主要場所，又是活性氧作用最敏感的部位，活性氧會對線粒體造成氧化損傷，進而誘導細胞凋亡[11]。5個毒性作用終點的主成分分析得知，單獨作用及聯合作用均具有共同的主成分，推測可能由于黃曲霉毒素B1與雜色曲霉素對HepG2細胞的毒性作用位點基本一致，并且具有相似的信號代謝通路，使其聯合作用的類型為加和作用。

4 結語

此次研究雖然僅從細胞水平對2種毒素的聯合作用類型進行判斷，但采用的多指標驗證方法為多種真菌毒素聯合作用的深入研究提供了參考。對于食品中真菌毒素的最大允許量，國家有明確的規定[12]，但規定中沒有提及兩種以上的真菌毒素共同存在時的限量標準，所以當兩種以上毒素共存時，其含量分別符合限量標準，但如果其聯合加和或協同作用，則會對人體造成更大傷害。因此，通過研究食品中常見的真菌毒素共存時的聯合作用，可為食品安全提供更準確的理論依據。

[1]Ruiz M J，Franzova P，Juan-Garcia A，et al.Toxicological interactions between the mycotoxins beauvericin，deoxynivalenol and T-2 toxin inCHO-K1 cells in vitro[J].Toxicon，2011，58：315-326.

[2]熊麗林，唐萌，王加生，等.微囊藻毒素和黃曲霉毒素及伏馬菌素聯合毒性[J].中國公共衛生，2006，22（5）：548-549.XIONG Lilin，TANG Meng，WANG Jiasheng，et al.Combinative toxicity of microcystin，aflatoxin and fumonisin[J].China J Public Health，2006，22（5）：548-549.（in Chinese）

[3]Sivakumar V，Thanislass J，Niranjali S，et al.Lipid peroxidation as a possible secondary mechanism of sterigmatocystin toxicity[J].Hum Exp Toxicol，2001，20（8）：398-403.

[4]Noor F，Niklas J，Muller-Vieira U，et al.An integrated approach to improved toxicity prediction for the safety assessment during preclinical drug development using HepG2 cells[J].Toxicol Appl Pharmacol，2009，237（2）：221-231.

[5]趙博，王中偉.細胞色素P450的研究進展[J].山東農業大學學報：自然科學版，2004，35（1）：142-144.ZHAO Bo，WANG Zhongwei.New progress in studies on cytochrome 450[J].Journal of Shandong Agricultural University：Nature Science Edition，2004，35（1）：142-144.（in Chinese）

[6]趙玉坤，楊曉臨，王丹.細胞培養的基本條件[M].上海：上海科學技術出版社，2004：23-37.

[7]LIU Yitong，Thomas J Flynn.Effects of dietary phenolics and botanical extracts on hepatotoxicity-related endpoints in human and rat hepatoma cells and statistical models for prediction of hepatotoxicity[J].Food and Chemical Toxicology，2011，49：1820.

[8]呂品田，周坤，王亞珍，等.薏苡仁注射液（康萊特）聯合順鉑對人肺腺癌細胞A549抑制作用及機制[J].中成藥，2011，33（3）：393-396.LUE Pintian，ZHOU Kun，WANG Yazhen，et al.Effect of Kanglaite Injection associated with Cisplatin in lung adno carcinoma cells A549[J].Chinese Traditional Patent Medicine，2011，33（3）：393-396.（in Chinese）

[9]McKean C，Tang L.Comparative acute and combinative toxicity of aflatoxin B1 and fumonisin B1 in animals and human cells[J].Food and Chemical Toxicology，2006，44：868-876.

[10]Ficheux A S，Sibiril Y，Parent-Massin D.Co-exposure of Fusarium mycotoxins：In vitro myelotoxicity assessment on human hematopoietic progenitors[J].Toxicon，2012，60：1171-1179.

[11]Stefano Costa，Aneli Utan，Ester Speroni，et al.Carnosic acid from rosemary extracts：a potential chemoprotective agent against aflatoxin B1[J].Appl Toxicol，2007，27：152-159.

[12]中華人民共和國衛生部.GB 2761-2011，食品中真菌毒素限量[S].南京：鳳凰出版社，2011.