和厚樸酚脂質體的制備及表征

吳德強

（南昌大學第二附屬醫院 江西南昌330006）

和厚樸酚（honokiol）是厚樸中的主要有效成分之一，是厚樸發揮藥效的重要物質基礎。現代藥理學研究證實，和厚樸酚除了具有抗炎、抗菌、抗氧化、拮抗鈣調素、調節胃腸功能等多種藥理活性[1～2]，還具有明顯的抗腫瘤活性[3～5]。由于結構中含有酚羥基，所以穩定性不好，容易被氧化。尤其是其水溶性差，大大限制了和厚樸酚的制劑開發和臨床應用。脂質體作為一種藥物載體，可以將一些不穩定、易氧化的藥物包封在脂質體中，藥物因受到脂質體雙層膜的保護，在很大程度上提高了藥物的穩定性，又解決了難溶性藥物的溶解性，延長了和厚樸酚在血液中的半衰期。同時利用腫瘤新生血管的增強滲透和滯留（EPR）效應，使藥物借助納米脂質體遞藥系統往腫瘤部位靶向遞藥。本研究設計將和厚樸酚包裹于脂質體中，改善和厚樸酚穩定特性和溶解性；同時利用腫瘤EPR被動靶向作用提高和厚樸酚的治療效果；以包封率為指標，采用正交實驗篩選并優化了其處方和制備工藝，旨在探索包封率高、緩控釋給藥的和厚樸酚脂質體。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 采用RE-52型真空旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；超聲波細胞粉碎儀（寧波新芝器儀研究院）；粒徑與ζ電位分析儀（model 380XLS，Nicomp TM，Santa Barbara，CA，USA）；島津高效液相色譜系統；島津SPD-10A紫外檢測器；3K透析袋（綠鳥科技）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；超濾管（MW 3000，Millipore）；XW280A 型旋渦混合器（上海青浦滬儀器廠）；透射電鏡（Joel JEM-1230，Japan）。

1.2 試劑 大豆卵磷脂（上海太偉藥業）；膽固醇購于美國sigma公司；和厚樸酚（深圳美荷生物科技有限公司）；甲醇（色譜純）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 和厚樸酚脂質體的制備 采用薄膜水化-擠出法制備和厚樸酚脂質體：精密稱取大豆卵磷脂、膽固醇、和厚樸酚置于茄形瓶中，加入乙酸乙酯使脂質完全溶解。將茄形瓶置旋轉蒸發儀上，40℃減壓蒸發有機溶劑，使脂質溶液形成一層均勻薄膜。真空干燥過夜，使溶劑除盡。加入磷酸鹽緩沖液（PBS）水化，探頭超聲。水化液經 0.80、0.45、0.22 μm 濾膜高壓擠出，得和厚樸酚脂質體混懸液，置于4℃冰箱保存備用。

2.2 和厚樸酚脂質體包封率測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：大連依利特C18柱（150 mm×416 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水 -冰乙酸（70∶30∶0.2）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：254 nm；柱溫：25℃。

2.2.2 標準曲線繪制 配制質量濃度為0.5、2.0、5.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL 的一系列和厚樸酚對照品溶液。按上述色譜條件進樣，以峰面積和質量濃度進行線性回歸，得回歸方程A=54 610－2 125.8（R2=0.999 8），在 0.5～20.0 μg/mL 濃度范圍內線性關系良好，精密度和回收率均符合分析要求。

2.2.3 包封率測定 和厚樸酚脂質體包封率測定采用超濾法：精密移取0.3 mL脂質體膠體溶液于超濾管中，離心10 min，吸取下層液，甲醇稀釋后，取20 μL按照2.2.1條件測定藥物含量。計算未包封的和厚樸酚量（M1）。另外精密移取0.3 mL脂質體膠體溶液，用甲醇破乳后測定和厚樸酚，計算膠體溶液中和厚樸酚量（M2），計算包封率（EE%），計算公式為 EE%=（M2－M1）/M2。

2.3 正交試驗優化和厚樸酚脂質體質體處方 脂質體制備工藝因素及處方因素都會影響脂質體的藥物包封率，所以，本研究在前期試驗時采用單因素分析方法考察薄膜分散法制備和厚樸酚脂質體的一些工藝和處方條件，在單因素考察的基礎上，通過正交設計試驗優化和厚樸酚脂質體處方和制備工藝。

2.3.1 因素和水平的選擇 在單因素考察的基礎上，以脂質體的包封率為考察指標。選擇影響脂質體包封率的主要因素：磷脂與藥物的重量比（A）、磷脂與膽固醇的重量比（B）、水相介質種類（C）及超聲時間（D）4個對包封率影響較大的因素作為考察因素，每個因素設3個水平。見表1。

表1 因素水平表

2.3.2 正交試驗結果分析 選用L9（34）正交試驗設計表安排9次試驗，制得和厚樸酚脂質體，分別測定和厚樸酚包封率。見表2。根據正交試驗表，從極差R來看，各因素對包封率的影響大小次序為：A＞B＞C＞D。在試驗所選的范圍內，超聲時間對和厚樸酚包封率的影響最小，磷脂與藥物的重量比對包封率影響最大。根據實驗結果，并綜合經濟原則，最后確定最佳工藝和處方條件為A1B1C3D1，即磷脂與藥物的重量比為60∶1，磷脂與膽固醇的重量比為20∶1，水化介質為pH 6.5磷酸鹽緩沖液，超聲時間為6 min。

2.4 工藝驗證 為了進一步驗證上述優化處方和工藝的穩定性和可行性，以優化出的最佳工藝進行3次驗證實驗，和厚樸酚包封率結果可從表3中看出，用優化后的處方和工藝制備的和厚樸酚脂質體包封率比其他正交試驗的結果都更好，說明優化成功，優化處方和工藝穩定、可行。見表3。

表2 L9（34）正交試驗設計結果

表3 驗證試驗結果

2.5 酚脂質體理化表征 采用上面優化的處方和工藝條件制備和厚樸酚脂質體，通過測定粒徑和體外藥物的累積釋放率對其物理化學性質進行表征。

2.5.1 粒徑分布 采用粒度/Zeta電位測定儀，測定和厚樸酚脂質體的粒徑分布。為防止多散射現象，樣品均用去離子水稀釋至適當濃度后測定。結果和厚樸酚脂質體粒徑呈現正態分布趨勢，平均粒徑為150 nm左右，非常有利于通過EPR效應進入腫瘤組織。

2.5.2 和厚樸酚脂質體體外釋放 采用透析法考察和厚樸酚脂質體的體外釋放行為。釋放介質為含0.5%吐溫-80的PBS溶液[6]。取1 L和厚樸酚脂質體溶液加入到預溶脹的透析袋內（MWCO=5 000 Da），扎緊袋口，放入裝有50 mL釋放介質的容器中，于37℃恒溫水浴，100 rpm振蕩下進行釋放實驗。按照預先設定時間從釋放介質中取樣0.5 mL，同時補入等量37℃空白釋放介質。采用HPLC法測定釋放樣品中的和厚樸酚濃度，以和厚樸酚的DMSO溶液作為對照。結果和厚樸酚DMSO溶液體外釋放快且釋放完全，說明透析袋對和厚樸酚吸附較少，可以用來評價和厚樸酚脂質體的體外釋放行為。和厚樸酚脂質體無明顯突釋現象，呈現出緩慢釋放，尤其是24 h幾乎接近零級釋放。所以和厚樸酚脂質體不僅可以改善和厚樸酚穩定性和溶解性能，還具有緩控釋性能，為開發和厚樸酚的緩控釋制劑提供一定的借鑒作用。

3 討論

脂質體制備過程中常常遇到包封率不高等問題，通過前期預試驗發現，影響脂質體包封率的因素是多方面的。因此，本實驗我們選取部分重要影響因素，通過正交試驗設計和分析，優化出高包封率的工藝和處方因素，并對優化出來的和厚樸酚脂質體進行體外理化性能的表征。本實驗制備的和厚樸酚脂質體為普通脂質體，如果對其表面進行適當修飾，可以得到預期各種功能性脂質體。比如對磷脂進行聚乙二醇（PEG）修飾后，可以得到長循環脂質體；各種抗原-抗體修飾可以制備各種免疫脂質體。這些修飾的脂質體更能夠發揮藥物在體內緩控釋及靶向效應。

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