In Situ PLA技術原位分析MTA1與NuRD復合體其他組分的相互作用△

劉健王海娟劉群李春曉劉歡黃驍舾孟希亭趙枚林晨黃常志#錢海利#

都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，北京 100020

國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室，北京100021

都醫科大學附屬北京婦產醫院婦科腫瘤，北京100006

MTA1是1993年Pencil等利用差異cDNA文庫篩選技術，從具有轉移潛能的大鼠乳腺癌細胞株13762NF中篩選分離出的一個乳腺癌轉移相關基因[1]。隨后大量研究表明MTA1普遍高表達于乳腺癌、肺癌、腸癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、卵巢癌、胸腺癌、肝癌、子宮內膜癌、前列腺癌等大多數類型的人類腫瘤組織中，參與了腫瘤侵襲轉移、血管生成、上皮間質轉化、細胞增殖、放化療耐受等眾多惡性行為的調控過程[2]。

MTA1/NuRD復合體是目前發現的MTA1參與腫瘤調控的一個最主要機制。NuRD即核小體重塑及組蛋白去乙酰化復合體，它由HDAC1、HDAC2、RbAp46、RbAp48、MTA1、MBD3 及 Mi2七種蛋白組成[3]。通過NuRD復合體MTA1在細胞核內抑制了多種腫瘤抑癌基因的表達，如BRCA1[4]、p21 WAF1[5]、HIC1[6]等。但最近研究表明MTA1不僅定位于胞核，在胞質中也有明顯的分布，我們課題組的大量研究數據也充分證明了這一點。對于胞質定位的MTA1是否也存在于NuRD復合體中并通過其發揮功能這一疑問，至今還未見報道。

In Situ PLA技術是瑞典的Olink Bioscience公司發明的一項可以用于原位定量檢測蛋白相互作用的新技術。鄰位連接技術（proximity ligation assay，PLA）的原理是使用一對標記有一段寡聚脫氧核苷酸（單鏈DNA）的二抗探針（PLA探針）分別識別兩種已經結合了不同目的蛋白的一抗，如果這兩種目的蛋白具有相互作用，那么此時兩個PLA探針之間的距離就會非常接近（＜40 nm），即產生了所謂的鄰近效應（proximity）。此時，通過加入一段分別與連接在抗體上的DNA互補的連接寡聚脫氧核苷酸，PLA探針上的DNA就會與該段DNA互補，然后在連接酶的作用下，形成一個閉環。然后再加入含有熒光標記的核苷酸和聚合酶的擴增緩沖液，通過滾環擴增（rolling circle amplification，RCA）最終可以在相互作用位點形成數百個密集的DNA環，而高濃度的熒光信號在熒光顯微鏡下顯示為一個明亮的斑點，易于檢出[7]。在本研究中，我們將In Situ PLA技術應用于原位驗證MTA1與NuRD復合體其他組分的相互作用，并進一步實施亞細胞定位分析。

1 材料與方法

1.1 細胞

HCT116細胞為ATCC來源，培養條件為DMEM+10%胎牛血清，5%CO2。

圖1 體外IP實驗證實MTA1與HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用

1.2 抗體與Duo-link試劑盒

鼠源MTA1一抗購買于Abcam公司；兔源Mi2和MBD3一抗購買于SANTA Cruze；兔源HDAC2一抗購買于Bioworld公司；Duo-link試劑盒購買于Olink Bioscience公司。

1.3 體外co-IP實驗

圖2 原位顯示MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用

實驗步驟：①收集10 cm大皿的細胞，NP-40裂解液裂解，提取蛋白，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量；②取500μg總蛋白，加入2μg的MTA1一抗，于4℃搖床孵育過夜；③加入20μl proteinA/G beads（Santa Cruze），4℃搖床 2 h；④離心收集beads，NP-40裂解液洗滌6次；⑤使用25 μl蛋白上樣緩沖液煮沸10 min，離心收集上清液；⑥采用Western Blot法鑒定捕獲的蛋白。

1.4 In Situ PLA實驗

按照Duo-link試劑盒說明書操作，大致步驟為：①制備HCT116細胞爬片；②將爬片固定于載玻片上，經多聚甲醛固定，Triton-X打孔，BSA封閉后加入鼠源MTA1一抗及另一種待測蛋白的兔源一抗，4℃孵育過夜；③加入試劑盒中帶標記探針的二抗Mouse-PLUS和Rabbit-MINUS，于37℃下孵育1 h；④加入連接反應液，于37℃下反應30 min；⑤加入擴增反應液，于37℃下反應100 min；⑥封片，熒光顯微鏡下檢測紅色斑點狀陽性信號。

2 結果

2.1 IP 技術證明HCT116 細胞中MTA1 與HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用

研究報道MTA1是NuRD復合體的一個重要組分[3]，在前期IP-質譜實驗中我們也發現利用MTA1抗體可以捕獲所有已知的NuRD組分，并且通過體外co-IP技術，我們證實HCT116細胞裂解液中MTA1與NuRD組分-HDAC2、Mi2、MBD3具有明顯的相互作用（圖1）。

2.2 In Situ PLA 技術原位顯示MTA1 與HDAC2、Mi2、MBD3在胞內的相互作用

體外實驗無法完全模擬復雜的細胞內環境，因此接下來我們首次利用In Situ PLA技術對MTA1與NuRD復合體其他組分HDAC2、Mi2、MBD3的相互作用進行了體內原位檢測。如圖2所示，紅色點狀顆粒即表示兩種蛋白具有相互作用，為相互作用陽性信號。結果表明MTA1與Mi2、HDAC2、MBD3均具有明顯的胞內相互作用。因為陽性信號數量的多少可以間接反映相互作用能力強弱，因此我們進一步對50個細胞內的陽性信號進行計數分析，結果表明MTA1-HDAC2組陽性信號數最多，為363個；MTA1-Mi2組次之，為280個；而MTA1-MBD3組最少，為208個，表明這三者中MTA1-HDAC2相互作用能力最強，MTA1-Mi2次之，MTA1-MBD3最弱。以MTA1-IgG為陰性對照，分別原位檢測MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用，圖中紅色斑點顆粒即表示一個相互作用反應。箭頭指示該相互作用位于胞質

2.3 MTA1/NuRD復合體在間期細胞中的亞細胞定位分析

最初文獻報道MTA1是一個核定位蛋白，因此之前研究均將MTA1/NuRD視為一個核定位的轉錄抑制復合體進行功能探索。但是最近大量文獻提示MTA1也分布于胞質中，并有可能在胞質中發揮重要功能[8]，因此我們進一步對MTA1/NuRD復合體進行了亞細胞定位分析。結果表明在Mi2、HDAC2及MBD3三個實驗組中分別有25.0%、22.1%及27.0%的胞質定位信號，表明MTA1/NuRD復合體在胞質中也有分布，其比例約占總數的 1/4（圖 3）。

圖3 對間期細胞中MTA1與Mi2、HDAC2及MBD3的相互作用信號進行定量分析

2.4 MTA1/NuRD 復合體在M 期細胞中的亞細胞定位分析

根據陽性信號分布，我們進一步對MTA1/NuRD復合體在有絲分裂期（M期）細胞中的分布進行了定位研究。結果我們首次發現，雖然在間期MTA1-Mi2主要作用于胞核，但是進入M期后，幾乎全部的陽性信號均分布于凝集的染色體外周（圖4）。MTA1-HDAC2及MTA1-Mi2相互作用的原位分析均得出一致的結果。該結果不僅進一步證實MTA1/NuRD復合體的確存在胞質分布，也提示MTA1/NuRD復合體可能參與了細胞周期調控。通過檢測MTA1-Mi2在HCT116細胞中的相互作用，原位顯示MTA1/NuRD復合體在有絲分裂期的亞細胞定位。圖中紅色斑點顆粒即表示一個相互作用反應。

圖4 MTA1/NuRD復合體在M期細胞中的分布

3 討論

腫瘤轉移相關蛋白MTA1在腫瘤發生發展尤其是侵襲遷移過程中發揮至關重要的作用。目前MTA1的功能研究主要集中于胞核轉錄因子。然而最近有多篇文章報道MTA1存在胞質定位，并且有文章研究指出MTA1在胞質中可能參與內吞過程[8]。

NuRD復合體是目前發現的MTA1促進腫瘤發生發展的最主要作用機制。但是關于MTA1與NuRD復合體的相互作用現在只有體外的IP-質譜證據，研究者同時指出NuRD復合體中的約70 kD的蛋白有可能是一個與MTA1非常相近的蛋白。在本實驗，我們首次通過In Situ PLA實驗對MTA1與NuRD復合體其他組分之間的相互作用進行了體內原位分析，從體內水平進一步驗證了MTA1是NuRD復合體的一個組分。

Mi2、HDAC2、MBD3是NuRD復合體中的關鍵因子，其均與染色質結構調控有關。通過陽性信號數量分析，我們判斷在NuRD復合體中，MTA1與HDAC2的相互作用能力最強，Mi2次之，而MBD3最弱。由于In Situ PLA實驗的作用基礎是兩個蛋白分子有足夠近的距離，因而該結果說明在NuRD復合體中MTA1可能與HDAC2的距離更近，從而有更多的機會發生寡核苷酸鏈的連接反應，產生陽性信號。

雖然一直以來MTA1/NuRD復合體一直被當作一個核轉錄抑制因子，但是至今沒有確鑿的證據表明MTA1/NuRD復合體只存在于胞核。由于已經有多篇文章報道MTA1存在胞質定位，提示我們MTA1/NuRD復合體可能也存在胞質定位。In Situ PLA技術的一個最大的優勢就在于可以準確顯示兩個蛋白之間的作用位點。而通過該技術我們發現，MTA1/NuRD復合體不僅僅存在于胞核，在胞質中也有明顯分布，胞質中的分布量約占整個細胞總量的1/4。該結果進一步表明，MTA1有可能既可以通過NuRD復合體在胞核中參與抑制腫瘤抑癌基因的表達，也可以通過NuRD復合體參與胞質內生物學功能的調控，如胞質蛋白的去乙酰化等。

另外，雖然MTA1/NuRD復合體在間期主要存在于胞核（3/4），但是借助于In Situ PLA技術的原位指示優勢，我們還首次發現MTA1/NuRD復合體在M期幾乎全部存在于染色體周圍，表明在M期MTA1/NuRD復合體已經與染色質解離，無法參與基因的轉錄調控，但是很可能通過其胞質定位參與細胞周期進程調控。

［1］Toh Y,Pencil SD,Nicolson GL.A novel candidate metastasis-associated gene,mta1,differentially expressed in highly metastatic mammary adenocarcinoma cell lines.cDNA cloning,expression,and protein analyses[J].J Biol Chem,1994,269(37):22958-22963.

［2］Toh Y,Nicolson GL.The role of the MTA family and their encoded proteins in human cancers:molecular functions and clinical implications[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(3):215-227.

［3］Xue Y,Wong J,Moreno GT,et al.NURD,a novel complex with both ATP-dependent chromatin-remodeling and histone deacetylase activities[J].Mol Cell,1998,2(6):851-861.

［4］Molli PR,Singh RR,Lee SW,et al.MTA1-mediated transcriptional repression of BRCA1 tumor suppressor gene[J].Oncogene,2008,27(14):1971-1980.

［5］Li DQ,Pakala SB,Reddy SD,et al.Revelation of p53-independent function of MTA1 in DNA damage response via modulation of the p21 WAF1-proliferating cell nuclear antigen pathway[J].J Biol Chem,2010,285(13):10044-10052.

［6］Van Rechem C,Boulay G,Pinte S,et al.Differential regulation of HIC1 target genes by CtBP and NuRD,via an acetylation/SUMOylation switch,in quiescent versus proliferating cells[J].Mol Cell Biol,2010,30(16):4045-4059.

［7］S?derberg O,Gullberg M,Jarvius M,et al.Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation[J].Nat Methods,2006,3(12):995-1000.

［8］Aramaki Y,Ogawa K,Toh Y,et al.Direct interaction between metastasis-associated protein 1 and endophilin 3[J].FEBSLett,2005,579(17):3731-3736.