熱性驚厥患兒白細胞介素—6基因多態性分析及血清神經元特異性烯醇化酶水平的研究

吳暉等

[摘要] 目的 探討白細胞介素-6（IL-6）基因多態性及血清神經元特異性烯醇化酶（NSE）水平與小兒熱性驚厥（FS）的關系。 方法 選擇2011年6月～2013年4月江西省兒童醫院收治的FS患兒90例為FS組，同期門診健康體檢兒童70例為對照組。采用PCR/RFLP對FS組與對照組小兒的IL-6基因的-572位點基因進行分析；同時采用ELISA法對患兒的NSE進行測定。 結果 IL-6基因-572位啟動區-572位點存在C→G單核苷酸替換多態性，在FS組與對照組間分布差異有統計學意義（P < 0.05），FS組-572位點G等位基因頻率均顯著高于對照組（P < 0.05）；FS組NSE水平明顯高于對照組（P < 0.01）。 結論 IL-6基因-572C/G多態性可能是兒童FS發病的遺傳危險因素之一；驚厥患兒易發生腦損傷，應盡早檢測血清NSE，且盡早進行干預治療。

[關鍵詞] 熱性驚厥；白細胞介素-6 ；基因多態性；神經元特異性烯醇化酶

[中圖分類號] R720.597 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）11（c）-0051-03

Study on the IL-6 polymorphism and NSE level in children with febrile seizures

WU Hui1 ZHANG Wuqiang1 LI Jun2 XU Nanping1 KE Jiangwei1

1.Department of Emergency， the Children's Hospital of Jiangxi Province， Nanchang 330006， China； 2.Department of Pediatrics， the People's Hospital of Ruichang City， Jiangxi Province， Ruichang 332200， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between interleukin-6 （IL-6） polymorphism and neuron specific enolase （NES） level in children with febrile seizures （FS）. Methods From June 2011 to April 2013， in the Children's Hospital of Jiangxi Province， 90 children with FS were selected as FS group， at the same time， 70 healthy children were selected as the control group. IL-6 gene -572 local gene of two groups was analyzed by PCR/RFLP； at the same time， NSE of FS group was measured by ELISA. Results the promoter region of the-572 site of IL-6 gene-572 lacal showed C→G single nucleotide substitution polymorphism， the difference of distribution between two groups was statistically significant （P < 0.05）， G allele frequency of -572 lacal in FS group were significantly higher than that in the control group （P < 0.05）； NSE level in FS group were significantly higher than that in the control group （P < 0.01）. Conculsion The IL-6 gene-572C/G polymorphism may be one of the genetic risk factors of children FS disease； FS children can be prone to brain injury， early detection of serum NSE， and early intervention.

[Key words] Febrile seizures； Interleukin-6； Polymorphism； NSE

熱性驚厥（febrile seizures，FS）是小兒時期最常見的驚厥性疾患，常見于6個月～5歲，發病率為3%～8%。熱性驚厥癥狀表現為患兒高熱，全身性抽搐，持續時間較短，抽搐時意識喪失，嚴重情況可轉變為癲癇、繼發智力低下和行為異常，對幼兒的身心健康造成嚴重威脅，患兒常常有家族史[1-2]。白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是由淋巴細胞和非淋巴細胞產生，是一種多功能的細胞因子，參與機體調節免疫應答和炎性反應等。研究報道FS患兒血清IL-6水平顯著增高，而其基因啟動子區域中-572C/G多態性是影響IL-6的重要因素[3-5]。IL-6基因-572C/G多態性可能是中國漢族兒童FS發病的遺傳危險因素之一。謝曉麗等[5]報道神經元特異性烯醇化酶（NSE）是FS分型及預后評估的有價值生化指標之一，能一定程度反映FS后腦損傷程度。本研究以江西省兒童醫院住院治療的FS患兒為研究對象，探討IL-6基因啟動子區域中-572C/G多態性及血清神經元特異性烯醇化水平與FS的相關性，從基因水平為探討小兒熱性驚厥發病機制提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇江西省兒童醫院2011年6月～2013年4月診治的FS患兒90例，為FS組，診斷標準參考《兒科學》第7版。根據《小兒神經系統疾病》提出的分型標準[6]：單純型：起病在6個月～4歲，高熱后很快出現驚厥，驚厥持續5～10 min，驚厥發作為全身性、兩側性，發作前后神經系統正常，熱退后1周腦電圖正常；復雜型：起病于任何年齡，可在6個月以內或6歲以上，低熱時出現驚厥，驚厥持續時間超過20 min，熱性驚厥復發5次以上，驚厥呈明顯限局性或明顯左右不對稱，有神經系統異常體征，有腦外傷或腦缺氧史，熱退1周后腦電圖正常。90例患兒中單純型熱性驚厥63例，復雜型熱性驚厥27例，所有患兒發作期間查腦電圖基本正常，排除有癲癇樣放電或彌漫性異常改變患者。其中男51例，女39例，平均年齡（3.6±1.3）歲；上呼吸道感染者52例，支氣管炎17例，支氣管肺炎11例，腸炎9例，細菌性痢疾1例。另選擇同期健康體檢兒童70例為對照組，排除有抽搐發作史和其他神經系統疾病史，其中男38例，女32例，平均年齡（3.8±1.2）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會通過，家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實驗儀器 PCR擴增儀（PCT-200型，BIO-RAD公司），瓊脂糖電泳儀（SUB-CELL型， BIO-RAD公司），凝膠成像儀（Universal Hood Ⅱ型， BIO-RAD公司），離心機（Centrifuge 5702型， Eppendorf公司），生物清潔工作臺（BSC-1500ⅡBC-X型， BIOBSE公司），酶標儀（RT-2000C型，成都貝斯達儀器有限公司）。

1.2.2 實驗試劑 PCR擴增試劑盒（編號SK2492，上海生工生物工程有限公司）；限制性內切酶（編號R0102L，New Englang Biolab公司）；引物（上海生工生物工程有限公司），NSE酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒（批號fk0163Y，上海科興商貿有賢公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 IL-6基因型的測定 FS組和對照組分別空腹取外周靜脈血3 mL，將其中1 mL抗凝后轉移至微量管，放置于-70℃冰箱保存；剩余2 mL置于普通試管中，標本采集后立即離心，置于-70℃冰箱保存。采用PCR/RFLP法進行基因型檢測并攝片，并采用PCR/RFLP對FS組與對照組的患兒IL-6基因的-572位點基因進行分析。

1.3.2 血清NSE測定 采用ELISA法分別測定FS組驚厥發作后血清NSE值，其中對照組僅測1次。①包被液稀釋抗原后，加50 μL于反應孔、分別加入FS組和對照組試樣50 μL于反應孔內，再立即加入50 μL的封閉液。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。②甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩3 min，甩去清洗液，拍干，重復3次。③每孔加入80 μL的親和鏈酶素，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。④甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩3 min，甩去清洗液，拍干，重復3次。⑤每孔加入工作液各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育40 min，避免光照。⑥取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應立即測定結果。ELISA讀板儀讀取450 nm波長處測定各孔的OD值。由江西省兒童醫院生化業檢驗師檢測。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組IL-6基因多態性測定結果

兩組所有研究對象均成功測出基因型。IL-6基因啟動區-572位點存在C→G單核苷酸替換多態性，G等位基因和C等位基因。FS組與對照組相比，基因型頻率在兩組間的分布差異有統計學意義（P < 0.05）。對照組CC基因型頻率顯著高于病例組（P < 0.05），IL-6基因-572位點基因型和等位基因頻率在FS組與對照組間分布差異有統計學意義，FS組-572GG基因型G等位基因頻率均顯著高于對照組（P < 0.05）。見表1。

2.2血清NSE測定

FS組血清NSE含量[（8.83±1.52）μg/L]明顯高于對照組[（3.92±1.34）μg/L]，差異有高度統計學意義（P = 0.008）。

3 討論

流行病學已證明，熱性驚厥有家族聚集性，具有明顯的遺傳傾向。家族性熱性驚厥占FS兒童25%～40%，其遺傳方式曾有單基因常染色體顯性、隱性和多基因遺傳等多種機制，傾向于單基因常染色體顯性遺傳方式。經熱性驚厥多病例家系分析發現多數熱性驚厥呈常染色體顯性遺傳伴不完全性外顯性，已發現數個染色體位點和許多基因與其相關。

IL-6具有調節免疫應答、參與炎性反應等多種功能，是中樞神經系統調節機體抗損傷防御的重要介質。袁紅霞等[7]研究發現IL-6在患兒體內有明顯的升高，與單純發熱患兒比較，FS患兒的含量更高，提示IL-6和小兒熱性驚厥的發病存在一定的關聯，且IL-6在熱性驚厥發熱過程中有一定作用。研究發現IL-6基因-572位點等位基因G組的血漿IL-6水平高于等位基因C組[8-13]，IL-6基因存在多種單核苷酸基因多態位點，主要位于啟動區，這些單核苷酸多態性（SNP）與FS的發生密切相關[14-18]。本研究通過在基因水平上探討IL-6基因-572C/G多態性及與小兒熱性驚厥的關系。FS患兒與對照組兒童IL-6基因-572位點多態性分析，發現IL-6基因-572C/G多態性在兩組間的分布差異有統計學意義（P < 0.05）。FS組GG基因型比例明顯高于對照組，而對照組CC基因型比例明顯高于FS組，進一步證實了小兒FS與IL-6相應SNP存在關聯性，為FS易感人群早期識別、預后分析提供進一步的臨床實驗數據。

NSE是神經元損傷的敏感性標志物，其高低可直接反映腦組織受損程度，故NSE是檢測腦神經元壞死的客觀指標，通過NSE來估價單純性與復雜性FS后腦細胞損傷情況，有助于其預后判斷及預防性抗驚厥藥的使用[19-21]。本研究結果表明，FS組NSE含量顯著高于對照組，差異有高度統計學意義（P < 0.01），表明FS患兒存在一定程度的腦組織的損傷，從而使患兒血清及腦脊液NSE水平明顯增加。因此盡早檢測血清NSE水平，積極地預防和保護中樞神經系統，有利于進行盡早干預治療。檢測NSE方法簡便，可以為臨床采取針對性措施提供有利幫助，檢測同時需要注意如果檢測樣品放置太久，否則會影響檢測結果，因而檢測樣品采集后需要及時送檢。

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（收稿日期：2014-08-11 本文編輯：蘇 暢）