異煙肼誘導致單耐異煙肼結核分枝桿菌假定藥物外排泵基因表達量變化的初步研究

王艷++陳璐

[摘要] 目的 觀察異煙肼誘導致單耐異煙肼結核分枝桿菌假定藥物外排泵基因表達情況，并探討導致該基因高表達的原因。 方法 選取30株單耐異煙肼結核分枝桿菌分離株、20株全敏結核分支桿菌分離株和H37Rv（標準對照），對不同菌株進行無異煙肼與亞抑菌異煙肼的誘導培養，采用Real-time PCR技術檢測27個假定外排泵基因表達量的變化，并且依據2-ΔΔCT進行計算假定藥物外排泵基因的表達差異倍數。 結果 30株單耐異煙肼結核分枝桿菌分離基因均可能導致結核分枝桿菌對異煙肼的假定藥物外排泵基因表達，且異煙肼會導致其外排泵基因的高表達。

[關鍵詞] 異煙肼；結核分枝桿菌；外排泵基因；表達量

[中圖分類號] R378 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）11（c）-0016-04

Preliminary study of isoniazid induced single INH resistant mycobacterium tuberculosis putative drug efflux pump gene expression variation

WANG Yan1 CHEN Lu2

1.Clinical Laboratory， Nanjing Thoracic Hospital， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Clinical Laboratory， Pukou District Center Hospital of Nanjing City， Jiangsu Province， Nanjing 211800， China

[Abstract] Objective To observe the expression of isoniazid induced to single resistance to isonicotinic acid hydrazide （INH） mycobacterium tuberculosis， and to discuss the possible cause of the high expression. Methods A total of 30 strains of single isoniazid resistant mycobacterium tuberculosis isolates， 20 strains of mycobacterium tuberculosis isolates and sensitivity of H37Rv （standard）， the different strains were cultured as hydrazine and sub inhibitory INH， and 27 putative efflux pump gene expression changes were detected by real-time PCR reverse transcription， and assuming multiple expression of drug efflux pump disease were calculated on the basis of 2-ΔΔCT. Results 30 strains of single INH resistant Mycobacterium tuberculosis isolates 18 strains of MIC was 2.0 μg/mL （14 strains katG 315 AGC-ACC mutations， 4 strains of non-mutant）， 8 strains of MIC was 1.0 μg/mL [4 strains katG 315 AGC-ACC mutations， 4 strains of inhA （-15） C-T mutation]， 4 strains of MIC was 4.0 μg/mL [3 strains of katG 315 AGC-ACC， 1 strain of ahpC （-88） G-A mutation]， 20 strains of Mycobacterium tuberculosis isolates sensitive without mutation. 27 putative drug discharge pump genes in the 11 genes showed high expression， mainly for Rv1258c， Rv2265， Rv0849， Rv0191， Rv1819c， Rv3239c， Rv2209， Rv2936， Rv2937， Rv1146， Rv2938c， and they were 5， 4， 4， 3， 3， 3， 2， 2， 2， 1， 1 strains/strain respectively. Conclusion In clinical， Rv1258c， Rv0849 and Rv2265 genes could lead to drugs on the assumption of ionized in mycobacterium tuberculosis efflux pump gene， and isoniazid can lead to high expression of discharge pump gene.

[Key words] Isoniazid； Mycobacterium tuberculosis； Efflux pump gene； Expression

結核病是臨床中常見疾病之一，在該病的控制過程中依然面臨著眾多問題，常見的有耐藥問題和人類免疫缺陷病毒與肺結核病毒的雙重感染以及流動人口等[1]。資料顯示，結核病患者耐藥性可以達到39.0%以上。耐藥結核疾病，特別是耐多藥結核病成為了國家結核疾病控制規劃的重大阻礙，也是導致當前疫情降低的最重要原因之一[2]。耐多藥結核病多數是由于異煙肼與利福平兩組或者多種藥物的拮抗作用而導致的。結核分枝桿菌耐藥主要是由于基因突變而導致藥物的作用靶位失去和細菌細胞壁的通透性發生改變，從而使得藥物不能有效地進入細胞內，并依賴主動外排系統將細菌胞內的藥物排出[3-4]。其耐藥機制主要是基因突變使得藥物的作用靶位喪失，另外細菌細胞壁通透性發生改變使得藥物不能夠直接進入到細胞內，依賴主動外排系統將細菌胞內的藥物排出。臨床中依據藥物外排機制的不同情況，外排泵可分為ATP水解能驅動型與跨膜質子梯度能驅動型兩個類型，還可以分為5個不同的主要超家族體現為MFS、ABC、RND、AMR家族和MATE家族[5]。資料顯示，結核分桿菌主要是通過藥物外排泵對異煙肼藥物做出應答反應，從而使其產生耐藥[6]。因此，本研究中重點探討異煙肼誘導致單耐異煙肼結核分枝桿菌假定藥物外排泵基因表達量狀況，并分析可能導致單耐異煙肼結核分枝桿菌假定藥物外排泵基因高表達的具體原因，具體的分析如下：

1 材料與方法

1.1 材料

本次研究的菌株均是由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核室所提供，30株單耐異煙肼結核分枝桿菌分離株、20株全敏結核分枝桿菌分離株、H37Rv（標準對照）。

1.2 儀器與試劑

ADC營養添加劑與Middlebrook 7H9干粉（美國BD公司）、異煙肼藥物干粉（美國Sigma公司）、Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、Alamar blue試劑（美國ABD Serotec公司）；除去DNA試劑盒（美國Invitrogen公司）、熒光定量PCR儀器（美國伯樂公司）、反轉錄試劑盒與熒光染料法Real-time PCR試劑（康為公司）。

1.3 基因組檢測

基因組主要是采取十六烷基三甲溴化銨（CTAB）法進行檢測，并且采取直接測序法進行檢測異煙肼耐藥的相關基因。同時，將PCR產物進行單向測序，并且采取生物信息學軟件對其進行基因序列和H37Rv基因序列進行對比分析，基因型的檢測采用Spoligotyping法進行辨別[7]。

1.4 最小抑菌濃度（MIC）檢測

結核分枝桿菌異煙肼的MIC主要是采取微孔板Alamar blue顯色法進行測定[8]。培養基中異煙肼的濃度為0.2 μg/mL，對于異煙肼MIC≤0.25 μg/mL的菌株，需要再次進行低濃度藥物的梯度稀釋，異煙肼需要按照0.0005～0.5 μg/mL的2倍系列稀釋，藍色完全沒有發生改變為最小藥物濃度。

1.5 假定藥物外排泵基因檢測

①依據N37Rv菌株全基因組序列進行管家基因secA1與27個假定藥物外排泵基因的選擇并設計引物。②細菌總RNA的制備，采取Trizol法進行提取總RNA，采取分光光度計進行測定總RNA的純度與濃度狀，以此進行質量測定。③去除DNA的污染，將提取的總RNA進行去污處理。經過上述的方法提取總RNA，體系為20.0 μL，主要包括100×DNaseⅠ

2 結果

2.1 基因突變觀察

30株單耐異煙肼結核分枝桿菌分離株中18株MIC顯示2.0 μg/mL（14株katG 315 AGC-ACC突變，4株無突變），8株MIC顯示1.0 μg/mL[4株katG 315 AGC-ACC突變，4株inhA（-15）C-T突變]，4株MIC顯示4.0 μg/mL[3株katG 315 AGC-ACC，1株ahpC（-88）G-A突變]，20株全敏結核分支桿菌分離株無突變。

2.2 假定藥物外排泵基因觀察

通過對標準株的27個假定藥物外排泵基因的表達差異倍數觀察，其差異倍數為0～1倍的10個，>1～2倍的12個，>2～3倍的5個，觀察過程中并未見有差異倍數超過3倍。同時，20株全敏結核分支桿菌分離株中的27個假定藥物外排泵基因的表達差異倍數觀察，0～1倍的13個，>1～2倍的13個，>2～3倍的1個。每個基因表達量差異倍數為0～2倍，甚至達到80.0%以上。

27個假定藥物外排泵基因中相對表達量差異倍數在部分菌株中天于4倍，一共有11個基因，主要體現為Rv1258c、Rv2265、Rv0849、Rv0191、Rv1819c、Rv3239c、Rv2209、Rv2936、Rv2937、Rv1146、Rv2938c。具體的株數見表2。

表2 30株單耐異煙肼結核分枝桿菌分離株中假定藥物外排泵基因高表達分布

3 討論

異煙肼是抗結核治療中的常見藥物，并且對結核桿菌具有較強的抑制與殺滅作用[10]。同時，其生物膜的穿透性相對比較好，且療效佳、毒性小，在臨床中被廣泛應用。資料顯示，異煙肼對結核分枝桿菌具有較高的選擇性，且抗菌作用也是相對比較強。一般情況下，試管內0.025～0.05 mg/L的濃度可以更好地抑制病菌，且臨床中較高濃度異煙肼（10.0 mg/L）對繁殖期的細菌具有較強的殺菌作用。同時，對于靜止期結核桿菌，能夠有效地提高藥物的濃度，或者是更好地延長接觸的時間，從而達到殺菌的作用，且對細胞內外結核桿菌也具有明顯的作用。研究顯示，異煙肼單獨使用很容易產生藥物的耐藥性，而聯合用藥能夠延緩藥物的耐藥性產生，最終增強其臨床療效。臨床中雖有研究進一步對異煙肼的作用機制分析，但其具體的作用尚不明確[11]。主要分為兩種情況，第一，異煙肼被轉化為異煙酸，而異煙酸主要是作為煙酸的一種抗代謝物，并且代替煙酸結合在NAD+，最終使得受到抑制的NAD+不被催化；第二，主要是通過阻斷去飽和酶而發揮作用，異煙肼能夠有效抑制C24、C26飽和脂肪酸轉化為C24、C26不飽和脂肪酸，而且這種不飽和脂肪酸很可能為霉菌酸前體，而霉菌酸也是細菌細胞壁的一種重要成分，該藥物可以更好地抑制霉菌酸生物合成，最終使得細菌的耐酸性喪失。但是，臨床中異煙肼暴露可能會引起結核分枝桿菌出現基因突變，且伴有藥物外排泵的活性增加。一旦這種基因發生突變，很容易引起結核分枝桿菌分離株產生耐藥，最終使得異煙肼治療結核病作用降低[12]。研究顯示，除基因突變導致異煙肼耐藥之外，外排泵激活也可以導致異煙肼耐藥的情況發生[13]。因此，本研究重點對30株單耐異煙肼結核分枝桿菌分離株和20株全敏結核分枝桿菌分離株進行異煙肼誘導，并且觀察27個假定外排泵基因的表達狀況，從而進一步了解其呈現高表達的具體原因。

通過本次的臨床研究分析，臨床中27個假定藥物外排泵基因中有11個基因呈現高表達，且這些基因的表達狀況均不相同。數據顯示，基因主要體現為Rv1258c、Rv2265、Rv0849、Rv0191、Rv1819c、Rv3239c、Rv2209、Rv2936、Rv2937、Rv1146、Rv2938c。由此分析，單耐異煙肼結核分支桿菌株中存在假定藥物外排泵基因高表達的情況，其具體可能是由于假定外排泵基因中的異煙肼被大量激活，從而使其呈現高表達[14-15]。同時，基因突變可能與藥物外排泵的激活也具有相關性，且katG315位置的基因突變更相關[16]。本組的數據也顯示，30株單耐異煙肼結核分枝桿菌分離株中18株MIC為2.0 μg/mL（14株katG 315 AGC-ACC突變，4株無突變），8株MIC為1.0 μg/mL[4株katG 315 AGC-ACC突變，4株inhA（-15）C-T突變]，4株MIC為4.0 μg/mL[3株katG 315 AGC-ACC，1株ahpC（-88）G-A突變]。進一步說明，katG315位置的基因突變在假定藥物外排泵基因高表達中發揮著重要的作用。臨床中相關研究顯示，多耐藥菌株可能是由于藥物外排泵基因的作用，并不是由于基因突變所引起的[17]。但是也有相關的研究顯示，外排泵基因可能起到促進其他耐藥作用機制，從而導致異煙肼的耐藥[18]。由于本次的臨床研究顯示，對于基因突變與外排泵之間的相關性依然需要臨床中大量實驗進一步研究，從而更準確地了解異煙肼耐藥情況。但是，本研究觀察例數較少，有待大樣本進一步研究觀察。

綜上所述，臨床中Rv1258c、Rv0849以及Rv2265等相關基因均可能導致結核分枝桿菌對異煙肼的假定藥物外排泵基因的高表達。

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：任 念）

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：任 念）

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：任 念）