全基因組表達譜芯片在新疆維 漢族膠質母細胞瘤患者中的應用研究△

劉 亮 欒新平（通訊作者） 夏海成 頓志平 朱正權 杜山別克 李文婷

1）新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 烏魯木齊 830011 2）新疆醫科大學第二附屬醫院 烏魯木齊 830063 3）山東大學第二醫院 濟南 250033

原發性膠質母細胞瘤（Glioblastoma）是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，WHO 分級Ⅳ級。大多數膠質母細胞瘤迅速直接的發生，很少有低度惡性前期病變［1］，其惡性度高，生存期短，預后極差。近年來，膠質母細胞瘤發病趨勢呈現年輕化，膠質母細胞瘤死亡率更是上升了近100%［3］。新疆是多民族聚居地區，流行病學分析顯示，維吾爾族（以下簡稱維族）膠質母細胞瘤患者中男性發病多于女性，發病年齡較漢族患者輕，但生存期高于漢族。新疆維、漢族患者高級別膠質瘤在發病及臨床特點等方面的不同，提示其在基因水平上，可能存在一定的差異性。本研究通過運用mRNA 表達譜芯片篩選新疆維、漢族患者高級別膠質瘤差異基因標志物，比較新疆維、漢族患者腦膠質母細胞瘤基因表達的差異性，初步探討維、漢族膠質母細胞瘤發病機制的差異。

1 資料與方法

1．1 一般資料 隨機選取2010—2013 年期在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院手術切除經病理證實為膠質母細胞瘤新鮮組織標本6例，其中維族3例，漢族3例；男2例，女4例；年齡29～56歲，中位年齡45歲；組織學分級均為Ⅳ級。標本均于-80℃的冰箱保存。所選病例經核實無重復，年齡、性別、民族、病理診斷、影像學表現、術后隨訪等臨床資料完整，術前均未進行放療和化療。

1．2 提取總RNA 及mRNA 表達譜芯片檢測 Trizol（Invitrogen，美 國）和The RNeasy kit（Qiagen，德 國）進 行 總RNA 提取，具體操作按試劑盒說明進行。采用1%瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop Spectrophotometer 2000對總RNA 質量分別進行定性及定量檢測。將樣本RNA 體外轉錄合成cRNA，經過質檢的cRNA 與雜交試劑混合形成雜交樣本，放到室溫孵育，經過高溫洗滌、乙醇洗滌及3次室溫洗滌，最后干燥，進行Illumina HT-12全基因組表達譜芯片掃描，讀取數據及獲取圖像。

2 結果

2．1 總RNA 提取的定量和定性分析 RNA 濃度＞100化ng／uL，RNA 總 量＞2 ug，經NanoDrop2000 檢 測，純 度A260／A280比值在均＞1．90。RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示18srRNA 和28srRNA 出現兩條帶清晰兩條帶，說明所提取組織的總RNA 完整性好，沒有降解，純度高，可用于后續mRNA 表達譜芯片檢測。

2．2 差異基因篩選及生物信息學分析 將芯片雜交掃描圖片導入Illumina GenomeStudio軟件，得到校正后的數據，利用R 語言lumi包進行標準化處理及差異基因篩選（P＜0．05）后，維、漢族膠質母細胞瘤全基因組表達譜的比較分析發現，篩選出顯著差異表達的基因共1 475個，其中表達上調有669個（44．84%），下 調有807個（55．16%）（其 中STRC基因對應2個轉錄本，1個轉錄本表達上調1個轉錄本表達下調），統計的差異基因均為公共數據庫中收錄的基因。對于篩選出來的差異基因，利用Web Gestalt軟件，對差異基因做GO（Gene Ontology）分析（P＜0．05）。通過統計每個GO條目中差異基因的個數，利用統計檢驗對差異表達的1 475個基因中做富集分析，計算差異基因富集的顯著性，分析發現有1 175個基因富集分布在代謝過程、生物調節、對刺激反應、多細胞的有機過程、細胞交流、細胞增殖等生物過程中。見表1。

表1 差異基因參與的主要生物過程

3 討論

腦膠質瘤作為最常見的原發性腦腫瘤，其中一半以上為惡性度最高的膠質母細胞瘤，其惡性度極高，患者即使采用了最為積極的治療手段，中位生存期仍然不容樂觀。研究表明，不同級別的膠質瘤的分子改變、用藥以及預后均有明顯不同［3-4］。近年來，國內外對于新疆維、漢族患者腦膠質瘤的研究大多停留在TP53、MGMT、VEGF等蛋白表達方面［5-6］，對于膠質瘤基因水平及膠質母細胞瘤的研究報道較少。新疆維、漢族患者高級別膠質瘤在發病及臨床特點等方面的不同，提示其在基因水平上，可能存在一定的差異性。

從基因水平探究其發病機制已成為膠質瘤研究領域的必然趨勢。和所有惡性腫瘤一樣，膠質母細胞瘤的發生發展也是一系列分子改變的結果，自1995年Schena等發表第一篇基因表達譜芯片文章以來，目前基因芯片法已廣泛應用于人類多種惡性腫瘤，如卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等［7］，同樣也應用與膠質瘤基因表達譜的研究。而對于篩選維、漢族膠質母細胞腫瘤的差異性表達，國內外尚未見報道。

本研究采用含有47 323個探針對應的31 330個基因的mRNA 表達譜芯片檢測了3例維族患者膠質母細胞瘤，3例漢族患者膠質母細胞瘤的mRNA 基因表達譜情況，發現差異表達的基因1 475個（4．7%）。經過軟件分析，篩選出顯著差異表達（P＜0．05）的1 475個基因中，表達上調有669個（44．84%），下 調 有807個（55．16%），其 中 有1個 基 因（STRC）對應2個轉錄本，1個轉錄本表達上調1個轉錄本表達下調。

篩選出來維、漢族膠質母細胞瘤的差異表達基因，涵蓋了膠質瘤分子診斷指南中常見分子標記物中的MGMT、TP53、IDH 等［8-9］。通過GO 分析，發現維、漢族膠質母細胞瘤之間的差異表達基因涵蓋了多個生物學過程，這些差異基因主要參與代謝過程、生物調節、對刺激反應、多細胞的有機過程等，其中包含小GTP酶調節信號通路、Ras信號蛋白通路、神經元反應蛋白調節、中樞神經系統髓鞘形成等多個功能節點。

在基因差異和通路功能方面，維族和漢族膠質母細胞瘤既有相同的差異表達基因，又各自有自己特有的差異表達基因。說明膠質母細胞瘤的發生發展中有其腫瘤共同的基因變化，又有民族之間的差異。對維族、漢族兩個民族共同的差異表達基因的研究，有助于我們對膠質母細胞瘤的發生發展的分子機制、信號傳導通路進行進一步的認識；而對兩個民族各自特有的共同差異表達基因的研究有助于我們進一步認識膠質母細胞瘤在發病機制上可能存在民族差異。

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