雷公藤紅素對荷瘤裸鼠移植瘤生長及血管生成的影響

姜 華 孫成法 褚榮濤 王君祥 周幽心 黃煜倫 謝學順

1）江蘇常熟市第二人民醫院神經外科 常熟 215500 2）蘇州大學附屬第一醫院神經外科 蘇州 215006

膠質瘤起源于中樞神經系統的膠質細胞，是神經系統中最常見的富含血管的實體腫瘤。雷公藤紅素是我國首先從雷公藤根中提煉的三萜色素類單體，是雷公藤的主要活性成分之一。研究發現，雷公藤紅素對血管內皮細胞有較明顯的體外抑制作用，IC50為1．33μg／mL［1］；而且雷公藤紅素通過多個方面抑制血管新生：雷公藤紅素抑制ECV 的小管形成，并呈劑量依賴性；雞胚尿囊膜血管生成試驗發現其血管生成抑制率達85．0%［2］；動物實驗中我們還發現雷公藤紅素抑制荷SHG44膠質瘤裸鼠移植瘤生長，而且通過下調周期蛋白D1及PCNA 的蛋白表達，對腫瘤細胞周期進行調控，減緩瘤細胞增殖［3-4］，但雷公藤紅素抑制血管生成的作用機制尚不明確。因此，我們進一步研究雷公藤紅素抑制血管生成的相關分子作用機制。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 人腦膠質瘤細胞株SHG-44由蘇州大學附屬第一醫院神經外科腦研室自行構建并留存。46 只雌性BALB／c裸小鼠，SPF等級，體質量（25±3）g，鼠齡5～7周，購自上海實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（滬）2002-0010。飼養于NASA1000 級生物凈化室內，按SPF 等級要求管理。二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma Chemical公司，RPMI-1640培養液購自Life Technologics公司，DMEM 培養液購自GIBCO BRL公司，小牛血清購自杭州四季青公司。雷公藤紅素（Celastrol）購自中科院上海藥物研究所，分子式C29H38O4，分子量450，純度＞97%。順鉑由昆明三戊貴金屬藥業生產。即用型SP 超敏試劑盒及檸檬酸鹽緩沖液（pH 6．0±0．1），CD34、VEGF單克隆抗體，bFGF、VEGFR1、VEGFR2多克隆抗體均購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1．2 裸鼠皮下荷瘤模型 復蘇膠質瘤細胞株SHG44，傳代培養于含10%小牛血清的RPMI-1640培養液。收集處于對數期生長的細胞，調整為密度2×107／mL 的單細胞懸液懸于不含血清的DMEM 培養基中，抽取細胞懸液0．5mL，分別接種于6只BALB／c裸鼠右腋部背側皮下。荷瘤裸鼠飼養于NASA1000級生物凈化室，皮下瘤塊生長至直徑約1．2 cm，進行裸鼠腫瘤傳代移植。接種裸鼠40只，2周后腫瘤形成約0．16cm3瘤塊，剔除荷有最大和最小瘤塊的裸小鼠各3只。

1．3 荷SHG-44膠質瘤裸鼠的治療 采用完全隨機設計方法，將接種成功的34 只荷SHG-44膠質瘤裸鼠隨機分成5組：溶媒對照組（A組），雷公藤紅素按3種濃度4mg／kg（B組）、2mg／kg（C組）、1 mg／kg（D 組）分組給藥，陽性對照順鉑組（E組）按2mg／kg給藥。每周2次，共給藥4周。所有組共投藥4周，以開始投藥時的所測腫瘤體積為基準，每隔5 d用游標卡尺測量腫瘤結節的最長徑和最短徑。腫瘤體積的計算公式V＝長徑×短徑×短徑／2。每周稱量荷瘤裸鼠體重以監測藥物毒性。28d后斷頸處死剔出腫瘤并測量腫瘤的最長徑和最短徑，病理醫生檢查每只荷瘤裸鼠肺、肝、腎組織。

1．4 腫瘤抑制率的測定 腫瘤抑制率＝（對照組體積-試驗組體積）／對照組體積×100%。

1．5 HE染色及免疫組織化學 腫瘤標本予10%甲醛固定，逐級脫水，常規石蠟包埋，連續4μm 石蠟切片。石蠟切片常規脫蠟水化后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5min×3次，檸檬酸鹽緩沖液（0．01 mol／L，pH∶6．0）微波修復，室溫冷卻后PBS洗5min×3次，10%正常羊血清封閉10min，滴加稀釋好的第一抗體（工作濃度為1∶100）60min，PBS洗5min×3次，生物素-SP標記二抗（即用型）孵育10min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色，顯微鏡下觀察3～10 min，自來水沖洗，蘇木素復染，梯度脫水，二甲苯透明。

1．6 微血管密度（microvesseldensity，MVD）計數及免疫組化的染色計數 （1）微血管密度（MVD）計數：參照Weidner微血管計數法［5］。血管內皮細胞胞漿呈棕黃色或棕褐色者為CD34陽性細胞。（2）免疫組化的染色計數：染色陽性表達為境界清楚、突出于背景的棕黃色或棕褐色顆粒。為兼顧染色強度（SI）和陽性細胞百分比（PP），采用免疫反應分數（IRS）表示其表達水平［6］，IRS＝SI×PP。SI分級：0 級為未見陽性細胞即陰性；1 級為弱陽性，染色顆粒散在分布，顯色較弱；2級為中度陽性，顯色強度適中；3 級為強陽性，細胞呈均一棕黃染色。PP分級：0級為陰性；1級≤10%；2級11%～50%；3級51%～80%；4級＞80%。

1．7 統計學處理 采用SPSS 13 軟件作單因素方差分析（ANOVA），計量數據采用均數±標準差（±s）表示，組間兩兩比較運用LSD-t檢驗。P＜0．05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2．1 荷SHG-44膠質瘤裸鼠的一般生長情況 各組荷瘤裸鼠生長狀況良好，體質量呈增加趨勢；移植瘤體積也呈增大趨勢，但生長速率不同。未觀察到明顯的不良反應，如活動遲緩、腹瀉、厭食等癥狀。移植瘤瘤體呈球形或不規則團塊狀，邊界尚清，有活動度，質地韌，可漸浸潤皮膚、肌肉，甚至骨骼，部分瘤體皮膚有壞死。見圖1。

圖1 荷SHG-44膠質瘤裸小鼠

2．2 雷公藤紅素對荷SHG-44膠質瘤裸鼠移植瘤的抑制作用 各組荷SHG-44膠質瘤裸鼠的移植瘤測量體積見表1。自異體瘤塊移植后荷瘤裸鼠生長15d，各組皮下移植瘤平均體積已增長至0．16cm3，開始給藥；給藥第1天和第6天，5組移植瘤生長體積差異無統計學意義（F＝0．685，P＝0．608）。自給藥第11 天開始，空白對照組和雷公藤紅素1 mg／kg組腫瘤生長速率開始加快，各組移植瘤生長體積相比均有顯著性差異（F＝5．501，P＝0．002）。雷公藤紅素4mg／kg組、雷公藤紅素2mg／kg組、雷公藤紅素1 mg／kg組、陽性對照順鉑組的體積抑瘤率分別為35%、26．9%、12．8%、41．4%；與空白對照組相比，雷公藤紅素4 mg／kg組、陽性對照順鉑組的腫瘤生長體積比差異顯著（P＜0．01）；雷公藤紅素2mg／kg組與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0．05），并存在劑量依賴性。

表1 荷SHG44膠質瘤裸鼠的移植瘤體積 （±s，cm3）

表1 荷SHG44膠質瘤裸鼠的移植瘤體積 （±s，cm3）

注：與A組（空白對照組）比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

組別 n 體積第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天A組 10 0．1677±0．0246 0．2321±0．0547 0．7790±0．1715 1．1999±0．2604 1．7892±0．3676 2．8490±0．3937 B組 6 0．1626±0．0253 0．2014±0．0311 0．3701±0．0747＊＊ 0．6813±0．2454＊＊ 1．0490±0．2425＊＊ 1．8518±0．5492＊＊C組 6 0．1628±0．0252 0．2297±0．0464 0．4958±0．1746＊＊ 0．7957±0．2797＊＊ 1．3750±0．4283＊ 2．0812±0．6170＊D組 6 0．1573±0．0501 0．2486±0．0822 0．6001±0．2836 0．9370±0．2920 1．5416±0．4416 2．4837±0．7376 E組 6 0．1639±0．0284 0．2438±0．0437 0．4845±0．1749＊＊ 0．6733±0．1838＊＊ 0．9806±0．3043＊＊ 1．6683±0．5914＊＊

2．3 雷公藤紅素對荷SHG-44膠質瘤裸鼠移植瘤MVD 的影響 見圖2。不同劑量的雷公藤紅素對荷瘤裸鼠移植瘤的MVD 均有影響。

2．4 雷公藤紅素對荷SHG-44膠質瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達的IRS 見表2。5 組荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR1的免疫反應分數組間比較（LSD法）發現，雷公藤紅素4mg／kg、2mg／kg與1mg／kg組間比較無顯著差異；VEGFR2組間比較發現，雷公藤紅素4 mg／kg組與雷公藤紅素1mg／kg組比較差異顯著；bFGF組間比較發現，雷公藤紅素4mg／kg組與2mg／kg組、1 mg／kg組比較差異顯著。結果提示不同劑量的雷公騰紅素對荷瘤裸鼠移植瘤的VEGF蛋白表達沒有影響；雷公藤紅素不同劑量組均能下調荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR1 蛋白表達，但還不能認為3者之間有差別；雷公藤紅素4mg／kg組和雷公藤紅素2mg／kg組均能下調荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR2蛋白表達，且存在劑量依賴性。雷公藤紅素4mg／kg組和陽性對照順鉑組均能下調bFGF的蛋白表達。

圖2 雷公藤紅素對荷SHG-44 膠質瘤裸鼠移植瘤MVD 的影響

表2 荷SHG-44膠質瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的免疫反應分數（IRS） （±s）

表2 荷SHG-44膠質瘤裸鼠移植瘤的bFGF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的免疫反應分數（IRS） （±s）

注：與A組（空白對照組）比較，＊P＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 n bFGF VEGF VEGFR1 VEGFR2 A組10 6．00±1．15 3．31±1．27 5．98±1．29 6．13±1．54 B組 6 2．59±0．92＊＊ 2．95±1．15 3．39±1．10＊＊ 3．28±0．86＊＊C組 6 5．08±1．36 3．21±0．45 3．45±0．75＊＊ 4．50±0．94＊D組 6 4．89±1．41 2．58±0．66 4．56±0．91＊ 5．89±2．03 E組 6 4．67±0．79＊ 3．70±1．04 2．83±0．86＊＊5．36±1．14

3 討論

腫瘤的主要生物學行為特征是無限增殖，其無限增殖的前提是要有新生血管提供營養物質，新生血管是實體腫瘤生長的必備條件［7］。腫瘤血管生成不足可致腫瘤細胞程序性死亡，達到抑制腫瘤生長的目的。MVD 是表示腫瘤血管生成數量的有效指標，膠質瘤的微血管密度及形態結構與其預后及生物學行為密切相關。本研究發現，順鉑組對荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度沒有影響，與相關文獻報道結果一致。不同劑量的雷公藤紅素與對照組比較均能降低荷瘤裸鼠移植瘤的MVD；雷公藤紅素4 mg／kg 組、雷公藤紅素2 mg／kg組和雷公藤紅素1mg／kg組降低MVD 效果有差別，存在劑量依賴性；其中雷公藤紅素4mg／kg組抑制效果最明顯。可以推斷雷公藤紅素抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生長機制之一是其能降低荷瘤裸鼠移植瘤的微血管密度（MVD）。

Vogelstein和Kinzler研究小組已經證實［8］，腫瘤血管生成和生理狀態下的血管生成在基因表達上有明顯不同。這一發現為血管生成的基礎和臨床研究提供了重要資料。腫瘤血管生成是一個極其復雜的過程，Jain 和Carmeliet提出［9］，腫瘤血管通過出芽、套疊、血管生成擬態等6種可能機制而新生。VEGF和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等均是已知強烈的促血管生成因子。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的生物學作用是通過與其特異性的細胞表面受體-FGFR 結合而介導實現。血管內皮生長因子（VEGF）與內皮細胞上的酪氨酸激酶受體VEGFR 結合，通過Raf-MEKMAP 信號轉導途徑而發揮其生物學作用［10-11］。Kubota認為應用不同的方法封閉或阻斷VEGF／VEGFR 信號轉導途徑均可抑制腫瘤的血管生成，進而抑制腫瘤的生長［12］。

本文結果提示，雷公藤紅素對bFGF、VEGFR1、VEGFR2的蛋白表達有顯著下調作用，對VEGF蛋白表達沒有影響。雷公藤紅素影響荷SHG44膠質瘤裸鼠移植瘤MVD 的可能原因：（1）下調腫瘤組織中VEGFR 蛋白表達，使VEGF的信號轉導減弱，明顯降低了VEGF生物學效應的發揮，進而抑制內皮細胞的增殖和腔化；由于雷公藤紅素抑制荷瘤裸鼠移植瘤的VEGFR-2 蛋白表達存在劑量效應，更能抑制VEGF／VEGFR2所介導的血管內皮細胞分裂活性。（2）下調bFGF的蛋白表達，對抑制腫瘤血管生成有一定作用。因此，雷公藤紅素抑制荷SHG44膠質瘤裸鼠移植瘤生長的機制之一是其具有抗血管生成的生物活性。

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