益腸平對潰瘍性結腸炎小鼠結腸通透性的預防作用

黃循銣，王瑞幸，王承黨

2.福建醫(yī)科大學 生理學與病理生理學系，福州 350004

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的終身性疾病，主要表現為非特異性結、直腸炎癥。目前UC主要治療藥物有氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑及中藥[1]，益腸平是民間治療UC有效的中藥復方。本文采用2.5%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）定量灌胃誘導小鼠UC，并通過測定結腸損傷大體評分（macroscopic assessment of colonic damage，MACN）、結腸通透性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、結腸組織超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），評價益腸平對UC小鼠結腸通透性的預防作用，并初步了解其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性ICR小鼠120只，8～10周齡，體質量（27±2）g[福建醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK（閩）2009－0002]。

1.1.2 試劑及儀器 益腸平（由連翹、蚤休及泡山甲等12種中藥組成）生藥濃度1.235g／mL，由福建醫(yī)科大學藥學系提供；DSS（批號：4455H，美國ICN公司）；伊文思蘭（批號：104K3717，美國Sigma公司）；iNOS一抗（批號：9242P503B，美國 Labvision公司）；二步法抗兔免疫組織化學檢測試劑盒（批號：GK400305，廣州基因有限公司）；柳氮磺吡啶（Sulfasalazine suppositories，SASP，批號20090523，上海三維制藥有限公司）；SOD（批號20090413）、MDA（批號20090421）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。正置顯微鏡（BX50F型，日本Olympus optical有限公司）；超聲波細胞粉碎儀（GE50型，美國Thomas scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 小鼠隨機分為6組，每組20只：（1）正常 對照組；（2）模型對照組；（3）SASP 組；（4）益腸平高劑量組（YCP1）；（5）益腸平中劑量組（YCP2）；（6）益腸平低劑量組（YCP3）。

1.2.2 UC模型制作 模型對照組、SASP組及YCP1、YCP2及 YCP3組每天分別于10：00、14：00和18：00給予2.5%DSS溶液定量灌胃，每次30mL／kg，每天末次灌胃后給予足量混合配方顆粒飼料，次日08：00取走飼料，連續(xù)9d；正常對照組以蒸餾水代替2.5%DSS[2]。

1.2.3 治療 造模開始同時給藥：YCP1、YCP2及YCP3組分別給予相同容積（0.125mL／10g體質量）、不同生藥濃度（0.617、0.308、0.154g／mL）的益腸平溶液，每日2次，即每只小鼠用藥量分別為30.8、15.4、7.7g·kg－1·d－1。SASP組給予相同容積（0.125mL／10g體質量）的0.8%SASP懸液，每日2次。以上藥液均為灌胃，給藥時間距DSS給藥時間2h，連續(xù)9d。正常對照組及模型對照組以蒸餾水代藥[2]。

1.3 觀測指標

1.3.1 MACN評分 各組隨機取10只小鼠脫頸椎處死，取全結腸，漂洗后于解剖顯微鏡下觀察及評分。MACN＝潰瘍評分＋粘連評分＋糞便評分。潰瘍評分：0分：正常；1分：局部水腫、無潰瘍；2分：一個潰瘍，無增厚、水腫；3分：一個潰瘍伴增厚、水腫；4分：最明顯的潰瘍沿腸壁縱軸的長度＞1cm；5～10分：潰瘍長度沿結腸縱軸＞2cm（每一潰瘍增加1cm增加1分）。粘連評分：0分：無；1分：較少；2分：較多，不易分離。稀便：0分：無；1分：有[3]。

1.3.2 結腸通透性測定 取余下10只小鼠禁食不禁水24h，經肛門插入直徑為1mm硅膠管，注入0.5%肥皂水洗腸，15min后用清水沖洗2次。洗腸后30min，氯胺酮麻醉下自小鼠結腸給予1.5%伊文思蘭0.2mL，立即縫合肛門。15min后處死小鼠，取全結腸，剪開腸腔，用6mmol／L N－乙酰半胱氨酸漂洗。將腸段置于恒溫箱37℃12h烘干，稱重后放入1mL甲酰胺55℃孵育24h，取100μL孵育液于酶標儀上測定620nm波長處的吸光度，計算伊文思藍量。以進入腸壁內伊文思蘭的量（μg／mg腸段質量）反映結腸通透性[4]。

1.3.3 結腸組織MDA及SOD測定 取病變最明顯處0.5cm結腸組織，制備10%組織勻漿，經3次凍融后離心取上清液提純。結腸黏膜MDA及SOD的測定按試劑盒說明進行[4]。

1.3.4 結腸組織iNOS測定 取病變較明顯的部位0.5cm，常規(guī)固定、包埋、切片，采用免疫組織化學Envison TM二步法測定。結腸iNOS表達以細胞漿染為棕色或淺棕色為陽性，采用Image Pro－Plus 5.1圖像分析軟件進行定量分析。比較各組小鼠結腸組織單位面積陽性細胞數。

2 結 果

2.1 MACN評分 造模后3d模型小鼠均逐漸出現腹瀉、血便、消瘦等類似人類UC的表現。造模后9d正常對照組小鼠結腸黏膜光整，模型對照組結腸短縮，黏膜充血水腫明顯，見淺表潰瘍形成，部分見息肉樣隆起，其余各組結腸黏膜充血水腫較模型對照組減輕。模型對照組MACN評分較正常對照組顯著增高，SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組較模型對照組顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。YCP1、YCP2、YCP3組與SASP組比較，差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.2 結腸通透性 正常對照組結腸粘膜光整，少許呈淡藍色；模型對照組結腸粘膜充血水腫，病變處呈深藍色。模型對照組結腸通透性較正常對照組顯著增高，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組及YCP1、YCP2、YCP3組較模型對照組顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組較 YCP1、YCP2、YCP3組差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 結腸組織MDA、SOD水平 模型對照組較正常對照組小鼠結腸MDA水平顯著增高、SOD水平顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組與模型對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組與 YCP1、YCP2、YCP3組比較，差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.4 結腸組織iNOS表達 正常對照組iNOS無表達或僅少量表達于結腸黏膜上皮細胞的胞漿。模型對照組較正常對照組表達明顯增多，陽性區(qū)域位于結腸黏膜上皮細胞，腸腺上皮細胞，炎癥細胞及血管內皮細胞的胞漿。模型對照組iNOS陽性單位數值較正常對照組顯著增高，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組較模型對照組顯著降低，差別有統(tǒng)計學意義；SASP組較YCP2、YCP3組表達較低，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1，表1）。

表1 各組小鼠MACN評分、結腸通透性（EB／腸質量）、結腸MDA、SOD及iNOS的表達情況Tab 1 MACN，colonic permeability，MDA，SOD and iNOS expression level in different groups mouse

2.5 結腸通透性、MACN 評分、MDA、SOD 及iNOS的相關性分析 Pearson相關分析提示，小鼠結腸通透性與 MACN評分（r＝0.511，P＝0.009）、MDA（r＝0.470，P＝0.011）、iNOS（r＝0.542，P＝0.006）均有顯著正相關；與SOD（r＝－0.520，P＝0.007）呈顯著負相關。

3 討 論

UC以腹痛、腹瀉及黏液血便為主要癥狀，其發(fā)病機制未明。近年來，結腸屏障受損、結腸通透性增高逐漸成為UC發(fā)病機制研究的熱點。結腸屏障由機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障組成。當結腸屏障受損后，結腸通透性增高，腸腔內的細菌或食物等抗原進入腸壁，啟動腸道粘膜免疫反應進而導致腸道免疫及炎癥反應。通過人類炎性腸病患者及一些動物模型的研究已經發(fā)現，腸道通透性的改變在疾病發(fā)病數月之前就已出現，它可能是UC起病及反復發(fā)作的一個重要環(huán)節(jié)[5]。本研究采用2.5%DSS定量灌胃成功誘發(fā)小鼠UC，造模小鼠出現明顯的腹瀉、粘液血便，類似人類UC。UC小鼠結腸通透性與MACN明顯增高并呈密切正相關。與模型組比較，益腸平治療組MACN及結腸通透性明顯降低，差別有統(tǒng)計學意義，提示益腸平對UC小鼠結腸大體病理表現及降低結腸通透性均有顯著的改善作用。

腸道通透性受TNF－α等多種前炎癥因子網絡調節(jié)，并與腸黏膜的氧化應激狀況有關[4]。液體及溶質主要通過經細胞轉運途徑和細胞旁路途徑兩種方式進入結腸黏膜，后者主要是通過黏膜上皮細胞間的緊密連接來實現，是中、大分子通過腸道屏障的重要途徑。已有研究表明，結腸自由基產生增加，可導致結腸屏障受損，結腸通透性增高[4]。自由基包括氧自由基和NO自由基，SOD反映了組織清除氧自由基的能力，而MDA則是脂質代謝產物，它們反映了細胞受氧自由基攻擊的嚴重程度。而測定結腸組織iNOS，可以反映結腸NO自由基損傷程度。

益腸平由銀花、連翹、蒲公英、蚤休、茵陳以及赤芍等12種中藥組成。體內、外實驗研究已經表明，本方所含的銀花、連翹、蒲公英、蚤休對結腸桿菌、痢疾桿菌等腸道細菌有較強的抗菌作用；連翹有降低血管內皮滲透性的作用；茵陳有清熱抑菌，抑制腸管過度蠕動的作用。本配方是在用于臨床治療泄瀉的經驗方取得較好療效的基礎上，結合本病以免疫異常及感染為主要因素的發(fā)病機制，以健脾滲濕、去腐排膿、生肌斂瘡為治則配方而成，旨在消除潰瘍、調節(jié)免疫、促進炎癥吸收的作用。本研究結果提示，UC小鼠結腸SOD水平明顯降低，MDA及iNOS水平明顯增高，顯示UC小鼠結腸受自由基損傷明顯，益腸平治療后上述指標明顯改善，并呈劑量依賴性。各組小鼠自由基水平與結腸通透性密切相關，提示益腸平可能通過降低結腸黏膜自由基水平而降低結腸通透性。

綜上所述，益腸平能有效改善UC小鼠結腸通透性，這可能基于其可有效降低UC小鼠結腸自由基損傷、保護結腸屏障，但其進一步的分子機制尚需今后進一步研究。

[1]王瑞幸，黃循銣，方秋娟，等.補黃丹對小鼠免疫性潰瘍性結腸炎的治療作用[J].福建醫(yī)科大學學報，2006，40（1）：37－39.

[2]黃循銣，王承黨，王瑞幸.葡聚糖硫酸鈉自由飲用與定量灌胃誘導急性結腸炎模型的對比研究[J].胃腸病學，2009，14（1）：27－30.

[3]Fitzpatrick L R，Small J S，Doblhofer R，etal.Vidofludimus inhibits colonic interleukin－17and improves hapten－induced co－litis in rats by a unique dual mode of action[J].Pharmacol ExpTher，2012，342（3）：850－860.

[4]黃循銣，王瑞幸，王承黨.小鼠潰瘍性結腸炎結腸通透性改變及其與自由基的關系[J].中華消化雜志，2010，3（1）：557－559.

[5]Yan Y，Laroui H，Ingersoll A，etal.Overexperssion of Ste20－related proline／alanine－rich kinase exacerbates experimental colitis in mice[J].JImmunol，2011，187（3）：1496－1505.