血栓心脈寧對大鼠腦缺血再灌注損傷后血管內皮生長因子表達的影響

楊小霞，李國前，陳春雷，王杰華，潘 瑩

2.南安市第二醫院 神經內科，南安 362300

急性缺血性腦血管病是由于腦血流突然中斷而導致腦組織缺血、壞死的一種嚴重危害人類健康的疾病。預防和治療缺血性腦血管病已成為當前神經病學研究的一個重要課題。血栓心脈寧是治療腦缺血性疾病的中成藥，能降低血黏度、改善血小板聚集率、升高血流量[1]。本研究在建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，從促血管生長因子表達的角度探討血栓心脈寧的腦保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠24只，體質量250～300g（福建醫科大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK2012－0001）。隨機分為3組：假手術組、模型組和實驗組，每組8只。

1.1.2 試劑 血栓心脈寧片（吉林華康藥業股份有限公司），實驗時以無菌生理鹽水配制成所需濃度；兔抗大鼠血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（美國 Santa Cruz公司）；即用型免疫組織化學試劑盒（鼠／兔）（福州邁新生物技術開發有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；PCR試劑盒及逆轉錄試劑盒（美國MBI Fermentas公司），引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模型制作和給藥方法 實驗組于造模前每日灌胃給藥1次（800mg／kg）[2]，連續6d；假手術組和模型組予相同體積的無菌生理鹽水。模型組和實驗組參考改良Zea－Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型[3]。血流阻斷1h后拔出線栓，形成再灌注。假手術組大鼠接受相似手術處理，但是不插入線栓。再灌注24h后處死動物斷頭取腦，取右側大腦半球視交叉后6～11mm的腦組織備用。

1.2.2 H－E染色 大鼠腦組織制作5μm厚的石蠟切片，經脫臘至水，先后加入蘇木素、伊紅溶液進行染色，經脫水透明，中性樹膠封片，在200倍光學顯微鏡下觀察腦組織。

1.2.3 免疫組織化學法檢測VEGF蛋白的表達大鼠腦組織切片經脫臘至水，按照試劑盒說明書操作，兔抗大鼠VEGF一抗濃度1∶200，AEC室溫顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，水性封片劑封片。陰性對照用PBS代替一抗。陽性細胞計數：每只大鼠腦組織取5張切片，每張切片在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野，分別計數免疫反應陽性細胞數，取平均值。

1.2.4 半定量PCR法檢測VEGF mRNA的表達

取大鼠腦組織按Trizol法提取總RNA并進行逆轉錄反應。PCR擴增反應條件為：變性94℃30s→退火64℃30s→延伸72℃30s，反應循環數為34。反應完畢后擴增產物進行電泳，凝膠成像分析儀拍照記錄。用Quantity One圖像分析軟件測定各條帶灰度，以目的基因灰度值與β－actin灰度值的比值作為特異性擴增目的基因的半定量檢測值。

2 結 果

2.1 H－E染色結果 造模成功后，模型組和實驗組缺血區腦組織結構稀疏，神經細胞變形，核固縮，核碎裂，核溶解，并失去完整的結構（圖1）。

2.2 VEGF蛋白 VEGF免疫陽性細胞的胞質和／或胞核呈紅色。假手術組僅見少量VEGF陽性細胞表達；模型組VEGF陽性細胞表達較假手術組顯著增多，2組差別有統計學意義（P＜0.05）；實驗組VEGF陽性細胞表達較模型組顯著增多，2組差別有統計學意義（P＜0.05）（表1，圖2）。

2.3 VEGF mRNA VEGF mRNA在假手術組有微弱表達，在模型組表達較假手術組顯著增高，2組差別有統計學意義（P＜0.05），實驗組表達含量較模型組顯著增高，2組差別有統計學意義（P＜0.05）（表1，圖3）。

表1 各組大鼠VEGF表達的比較Tab 1 Comparison of the VEGF expression in different groups

圖1 各組大鼠腦組織H－E染色（ ×200）Fig 1 H－E staining of rats brain tissue（ ×200）

圖2 免疫組織化學法檢測大鼠VEGF蛋白表達（ ×400）Fig 2 VEGF protein expression detected by immunohistochemistry（ ×400）

圖3 PCR法檢測大鼠VEGF mRNA表達Fig 3 VEGF mRNA expression detected by PCR

3 討 論

缺血性腦損傷后，缺血半暗帶區的神經細胞如能及時恢復血流灌注，可使其神經功能恢復。VEGF為對血管內皮細胞最具特異性的有絲分裂原，能促進缺血局部血管再生，這對于改善缺血半暗帶血液供應，挽救瀕死的神經細胞意義重大[4]。同時有研究發現，VEGF能刺激軸突生長和改善神經細胞的存活，在病理狀態下對中樞神經系統有保護作用，局部應用 VEGF可有效減少梗死面積[5－6]。本研究結果發現，腦缺血再灌注損傷后，模型組VEGF的表達明顯高于假手術組，說明VEGF在缺血性腦損傷后水平是升高的。

血栓心脈寧系由川芎、丹參、水蛭、毛冬青、牛黃、麝香、槐米、人參莖葉皂苷、冰片和蟾蜍等中藥組成的復方制劑，具有芳香開竅、活血散瘀功能，主治腦血栓、冠心病、心絞痛等氣滯血瘀證者[7]。有研究表明，血栓心脈寧能明顯減輕腦缺血損傷后腦水腫，提高全腦缺血小鼠的耐缺氧能力，增加正常大鼠腦膜血流量[8]。本研究結果發現，腦缺血再灌注損傷后予血栓心脈寧進行治療，VEGF的表達明顯高于模型組，說明血栓心脈寧能促進腦缺血區促血管生成因子的表達，從而發揮腦保護作用。

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