血栓心脈寧對大鼠腦缺血再灌注損傷后血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

楊小霞，李國前，陳春雷，王杰華，潘 瑩

2.南安市第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，南安 362300

急性缺血性腦血管病是由于腦血流突然中斷而導(dǎo)致腦組織缺血、壞死的一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。預(yù)防和治療缺血性腦血管病已成為當(dāng)前神經(jīng)病學(xué)研究的一個(gè)重要課題。血栓心脈寧是治療腦缺血性疾病的中成藥，能降低血黏度、改善血小板聚集率、升高血流量[1]。本研究在建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，從促血管生長因子表達(dá)的角度探討血栓心脈寧的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量250～300g（福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號：SCXK2012－0001）。隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只。

1.1.2 試劑 血栓心脈寧片（吉林華康藥業(yè)股份有限公司），實(shí)驗(yàn)時(shí)以無菌生理鹽水配制成所需濃度；兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（美國 Santa Cruz公司）；即用型免疫組織化學(xué)試劑盒（鼠／兔）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國MBI Fermentas公司），引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模型制作和給藥方法 實(shí)驗(yàn)組于造模前每日灌胃給藥1次（800mg／kg）[2]，連續(xù)6d；假手術(shù)組和模型組予相同體積的無菌生理鹽水。模型組和實(shí)驗(yàn)組參考改良Zea－Longa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型[3]。血流阻斷1h后拔出線栓，形成再灌注。假手術(shù)組大鼠接受相似手術(shù)處理，但是不插入線栓。再灌注24h后處死動(dòng)物斷頭取腦，取右側(cè)大腦半球視交叉后6～11mm的腦組織備用。

1.2.2 H－E染色 大鼠腦組織制作5μm厚的石蠟切片，經(jīng)脫臘至水，先后加入蘇木素、伊紅溶液進(jìn)行染色，經(jīng)脫水透明，中性樹膠封片，在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測VEGF蛋白的表達(dá)大鼠腦組織切片經(jīng)脫臘至水，按照試劑盒說明書操作，兔抗大鼠VEGF一抗?jié)舛?∶200，AEC室溫顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，水性封片劑封片。陰性對照用PBS代替一抗。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：每只大鼠腦組織取5張切片，每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.4 半定量PCR法檢測VEGF mRNA的表達(dá)

取大鼠腦組織按Trizol法提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：變性94℃30s→退火64℃30s→延伸72℃30s，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為34。反應(yīng)完畢后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠成像分析儀拍照記錄。用Quantity One圖像分析軟件測定各條帶灰度，以目的基因灰度值與β－actin灰度值的比值作為特異性擴(kuò)增目的基因的半定量檢測值。

2 結(jié) 果

2.1 H－E染色結(jié)果 造模成功后，模型組和實(shí)驗(yàn)組缺血區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)稀疏，神經(jīng)細(xì)胞變形，核固縮，核碎裂，核溶解，并失去完整的結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2 VEGF蛋白 VEGF免疫陽性細(xì)胞的胞質(zhì)和／或胞核呈紅色。假手術(shù)組僅見少量VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)；模型組VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)較假手術(shù)組顯著增多，2組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組VEGF陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組顯著增多，2組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖2）。

2.3 VEGF mRNA VEGF mRNA在假手術(shù)組有微弱表達(dá)，在模型組表達(dá)較假手術(shù)組顯著增高，2組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組表達(dá)含量較模型組顯著增高，2組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖3）。

表1 各組大鼠VEGF表達(dá)的比較Tab 1 Comparison of the VEGF expression in different groups

圖1 各組大鼠腦組織H－E染色（ ×200）Fig 1 H－E staining of rats brain tissue（ ×200）

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠VEGF蛋白表達(dá)（ ×400）Fig 2 VEGF protein expression detected by immunohistochemistry（ ×400）

圖3 PCR法檢測大鼠VEGF mRNA表達(dá)Fig 3 VEGF mRNA expression detected by PCR

3 討 論

缺血性腦損傷后，缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞如能及時(shí)恢復(fù)血流灌注，可使其神經(jīng)功能恢復(fù)。VEGF為對血管內(nèi)皮細(xì)胞最具特異性的有絲分裂原，能促進(jìn)缺血局部血管再生，這對于改善缺血半暗帶血液供應(yīng)，挽救瀕死的神經(jīng)細(xì)胞意義重大[4]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF能刺激軸突生長和改善神經(jīng)細(xì)胞的存活，在病理狀態(tài)下對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用，局部應(yīng)用 VEGF可有效減少梗死面積[5－6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后，模型組VEGF的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，說明VEGF在缺血性腦損傷后水平是升高的。

血栓心脈寧系由川芎、丹參、水蛭、毛冬青、牛黃、麝香、槐米、人參莖葉皂苷、冰片和蟾蜍等中藥組成的復(fù)方制劑，具有芳香開竅、活血散瘀功能，主治腦血栓、冠心病、心絞痛等氣滯血瘀證者[7]。有研究表明，血栓心脈寧能明顯減輕腦缺血損傷后腦水腫，提高全腦缺血小鼠的耐缺氧能力，增加正常大鼠腦膜血流量[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后予血栓心脈寧進(jìn)行治療，VEGF的表達(dá)明顯高于模型組，說明血栓心脈寧能促進(jìn)腦缺血區(qū)促血管生成因子的表達(dá)，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

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[3]Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84－91.

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[5]Sondell M，Lundborg G，Kanje M.Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth，enhancing cell survial and schwann cell proliferation in the peripheral nervous system[J].Neurosci，1999，19（4）：5731－5740.

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[7]楊春梅，劉 兵，睢大員，等.血栓心脈寧膠囊對大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗死的保護(hù)作用[J].武警醫(yī)學(xué)，2005，16（5）：352－354.

[8]楊小霞，李國前，王杰華，等.血栓心脈寧片對大鼠腦缺血再灌注腫瘤壞死因子－ɑ的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2011，9（11）：1363－1364.